半夏泻心汤活性成分对ICC膜电位和线粒体膜电位的影响.pdfVIP

半夏泻心汤活性成分对ICC 膜电位及线粒体膜电位 的影响1 1 1 1 1 2 1 祝捷 ，黄颖 ，刘晓辉 ，洪庆涛 ，杨建茹 ，李宇航 1 北京中医药大学基础医学院，北京 （100029 ） 2 北京大学医药卫生分析中心，北京（100083 ） E-mail ：liyuhang@ 摘 要：目的： 观察半夏泻心汤活性成分小檗碱、黄芩苷、甘草次酸和人参皂苷Rg1 对小 鼠Cajal 间质细胞（Interstitial Cells of Cajal, ICC ）膜电位及线粒体膜电位的影响。方法：体 外分离培养ICC ，用小檗碱、黄芩苷、甘草次酸和人参皂苷Rg1 处理ICC ，作用24 小时后， 采用ICC 特异的c-kit 抗体进行免疫荧光测定，利用激光共聚焦显微扫描技术和特异性荧光 探针标记细胞膜电位及线粒体膜电位。结果：半夏泻心汤活性成分中小檗碱能明显提高ICC 膜电位、线粒体膜电位，甘草次酸和人参皂苷Rg1 能提高ICC 线粒体膜电位，黄芩苷对二 者均无明显作用。结论：半夏泻心汤调节胃肠动力的作用机制，可能与其活性成分提高ICC 膜电位及线粒体膜电位有关。 关键词：半夏泻心汤活性成分，Cajal 间质细胞，膜电位，线粒体膜电位，小檗碱，黄芩苷， 甘草次酸，人参皂苷Rg1 半夏泻心汤为调节胃肠运动障碍之良方。以往的实验研究中我们筛选出半夏泻心汤中发 挥调节胃肠动力作用的主要活性成分为小檗碱、黄芩苷、甘草次酸和人参皂苷Rg1 。为了进 一步明确其机制，我们以胃肠起搏细胞—Cajal 间质细胞（Interstitial Cells of Cajal, ICC ）为 着眼点，采用细胞分离、培养和激光共聚焦显微扫描等技术，通过观察半夏泻心汤活性成分 小檗碱、黄芩苷、甘草次酸和人参皂苷Rg1 对BALB/C 小鼠ICC 膜电位与线粒体膜电位的 影响，探讨半夏泻心汤调节胃肠动力的作用靶点及其作用机制。 1 材料和方法 1.1 实验动物 BALB/C 小鼠，出生后15～20 天，雌雄不拘，由北京大学医学院实验动物科学部提供。 1.2 药物与试剂 SMGM 培养基（Clonetics 公司），SCF （Sigma 公司），FBS （Hyclon 公司），大鼠抗小 鼠c －kit 抗体（Bioscience 公司），羊抗大鼠FITC 标记荧光抗体（北京中山公司）， Ficoll 400 （Sigma 公司），Di －8 －ANEPPS （Biotium 公司），JC-1 （Biotium 公司）， 小檗碱、黄芩苷、甘草次酸、人参皂苷Rg1 均购自中国生物药品检定所。 1.3 仪器 TCS-SP2 型激光共聚焦扫描显微镜（德国LEICA 公司），CO2 孵箱（SANYO 公司）。 1.4 实验方法 1.4.1 分离、培养ICC 出生后15～20 天BALB/C 小鼠，禁食 12 小时，脱颈椎处死，在无菌条件下取自幽门 1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金项目（No.20040026015 ）的资助。 - 2 - 环下 1cm 至回盲部的小肠，沿肠系膜侧剪开小肠，剥去小肠系膜、血管和小肠粘膜层，将 肌条剪碎至 1～2mm3 小块后放入小烧杯，37℃消化，30min 后，1500r/min，3min 离心，过 200 目筛网去除大块组织，将细胞加在等体积Ficoll 400 梯度密度液上，30g 离心30min，取 液面交界细胞沉淀，加入培养基，内含2%青－链霉素和鼠干细胞生长因子（murine stem cell factor，SCF）5ng/ml，接种至包被鼠尾胶原的 12 孔板中的盖玻片上或Petri 皿（MatTek 公 司）中间圆孔的盖玻片上，37℃