酵母双杂总结解析.doc

酵母双杂原理：酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，　转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开， 仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时， 测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达， 其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-ad没有。因此， 在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物(mammal;mammalian)的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd， LexA-bd)； 另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad， VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中， 蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)， 从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交文库构建基本实验流程 一 第一链cDNA合成 1. 准备高质量的Poly A 或总RNA 2. 在微量离心管中混匀以下试剂 RNA 样本 (0.025–1.0 μg poly A+或0.10–2.0 μg 总RNA) 1–2 μl 1.0 μl CDS III 1–2 μl 去离子水 补齐体系到4.0 μl 注: 对照实验时，请使用1μg的对照RNA。 CDSIII = Oligo-dT； CDSIII/6 =随机引物 3. 72°C ，孵育2 min。 4. 冰上冷却2 min，然后14000rpm，10s，瞬时离心。 5. 混合以下试剂，将混合液加入Step4中的经过变性且结合有引物的RNA样本中，轻拍混匀。 5X First-Strand 缓冲液 2.0 μl DTT (100 mM) 1.0 μl dNTP 混合物(10 mM ) 1.0 μl SMART MMLV 反转录酶 1.0 μl 6. 42°C，孵育10 min。 7. 加入 1 μl SMART III-modified oligo， 酵母细胞感受态的制备 1 在转化实验的两天前，于YPD培养基的平皿上活化酵母菌株(Y2H/Y187)。 2.??转化前一天，挑取活化的酵母细胞（单克隆）于YPDA液体培养基中，30°C， 200rpm培养8-12h。 3.?取5μl上述酵母细胞液于50ml的YPDA培养基中，???30°C，200rpm培养 8-12h至OD6001.5。 50ml 150ml 4.将上述酵母细胞液离心后转接到新的YPDA液体培养基中，使OD600=0.2， 30°C 200rpm培养4-6h，使OD600=0.5 300ml 1L 5. 700g?离心?5分钟收集酵母细胞，用无菌水或TE洗酵母细胞。 25-50ml 500ml 6.??再次700g?离心?5分钟。 7.??弃上清，用1.1×TE/LiAc重悬酵母细胞。 1.5ml 8ml 8. 往离心管里加入如下试剂及DNA: ? DNA-BD/baita ? AD/library ? Herring testes carrier DNA 0.1 μg 0.1 μg 0.1 mg 0.2–1.0