2015-免疫组织化学染色方法剖析.ppt

第八节 抗原定位及非特异染色 组织细胞 ＊固定问题 ＊脱蜡不彻底 ＊内源性过氧化物 ＊内源性生物素 抗原 ＊抗原弥散 ＊抗原异常表达 ＊共同抗原决定簇 特异性抗体 ＊非特异吸附 ＊抗体不纯 ＊交叉反应 第二抗体 ＊ IgG交叉反应 ＊ 二抗不纯 标记物 ＊质量 ＊纯度 ＊标记水平 底物溶液 ＊ DAB ＊ H2O2 操作 ＊复染 ＊抗体稀释度 ＊孵育时间 ＊ PAS洗涤 第九节 免疫酶方法评价 抗原---特异性抗体---第二抗体（桥抗体）---PAP ---第二抗体--- PAP复合物 组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 双PAP法 HRP 双PAP法 组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 HRP 步骤：五步法 特点：敏感性较高 缺点：但步骤多，费时，非特 异背景重 三、APAAP法 原理：抗原---特异抗体---第二 抗体--- APAAP复合物 步骤：三步法 APAAP法 特点：非特异背景较轻，不受内 源性酶的干扰。 但产物易溶于有机溶剂 第五节 卵白素---生物素法 Avidin为一种硷性糖蛋白，由 四个相同亚基组成 Biotin小分子维生素 Avidin和Biotin具有较高亲和力 一 、ABC法 Avidin Biotin Complex 原理：酶标记Biotin形成酶素化 Biotin 酶素化Biotin＋Avidin --- ABC 复合物 抗原---特异抗体--- Biotin标记 第二抗--- Avidin ● Biotin ● HRP 组织抗原 第一抗体 第二抗体 HRP 生物素 卵白素 ABC法 步骤：三步法 特点：敏感性较高，特异性强， 应用范围广 ● 某些脏器存在内源性生物素干扰 ● Avidin与核酸及细胞膜中磷脂 有非特异反应 SABC法 Streptavidin biotin Peroxidase Complex SABC法已代替ABC法 二、LSAB法 Labelled Streptavidin Biotin Method 原理： ● Biotin标记第二抗体 LSAB法 ● HRP标记Avidin 抗原---特异性抗体---Biotin标记第二抗体---Avidin ● HRP复合物 步骤：三步法 特点：敏感性高，特异性强， 方法简便 第六节 多聚合物酶法 多聚合物酶法 HRP---多聚合物---抗体 一、Epos法 Enhanced polymer one-step staining 组织抗原 一抗 HRP 多聚骨架 EPOS 方法 原理：采用一种具有惰性的多聚 化合物作为骨架，将特异 性抗体和HRP，同时标记 在多聚合物分子上，形成 HRP---多聚合物---特异性 抗体。 步骤：一步法 特点：快速，简便，特异性强， 敏感性高 但商品化种类不全， 价格昂贵 二、EnVision法 Enhanced Labelled Polymer System 原理：HRP ---多聚合物---第二 抗体 组织抗原 一抗 二抗 酶 多聚骨架 第一步 第二步 EnVisionTM方法 特点： 敏感性高：（1 mole复合物中含70mole HRP和10 mole第二抗体） 特异性强： 复合物内无内源性Avidin和Biotin的干扰。 第七节 基本操作步骤 ＊抗原修复 ＊内源性过氧化物抑制 ＊正常血清封闭 ＊第一抗体 ＊第二抗体 ＊酶标记体 ＊ DAB- H2O2显色 免疫酶特点： 信号定位准确 标本可长期保存 阳性标记与病变关系 方法简便，易推广 第二节 酶 和 底 物 一、酶及其特点 酶选择标准： ★ 该酶用细胞化学易于被检出， 能被光镜或电镜观察。 ★ 酶反应