FISH技术在血液疾病诊断中的应用.pptxVIP

荧光原位杂交（FISH）技术 ——血液肿瘤诊疗中的应用 一、技术 二、质控 三、临床应用 四、多技术结合应用案例 技术理论 1950-1960 1960-1970 1970-1980 1980-1990 显带时期 非显带时期 1888 提出 染色 体 1914 染色体 畸变导 致肿瘤 1956 确定 染色 体46 条 1958 应用 于血 液学 1960 发现Ph 染色体 CML 显带技 术高速 发展 G/R 多种血 液病相 关异常 核型被 发现 FISH 中期/间期 多色 FISH 微阵列技术 aCGH、aSNP CGH技术 分子遗传 细胞遗传学发展简史 FISH技术的发展 1990年 FISH 1992年 CGH 1996年 24色FISH （SKY、M-FISH、RX-FISH） 2001年 array CGH 技术原理 A G G C T A T T C C G A T A COVALENT BOND F F Specimen DNA FISH Probe DNA 操作步骤 FISH样本的制备（染色体制备、细胞滴片制备） 探针制备（体系：杂交缓冲液、蒸馏水、探针） 探针标记 杂交（76℃变性10min、37℃杂交10h） 洗脱 DAPIⅡ复染 荧光显微镜检测 结果分析 FISH技术的特点 • 操作简便，稳定，人员培训较快 • 方法敏感，特异性好，检测效率高，能迅速得到 结果，24小时就可以完成检测 • 标本来源丰富，细胞不需培养，间期细胞，分裂 中期细胞、分化或未分化细胞及死亡或存活的细 胞皆可以被检测 • 可与多种技术结合（细胞形态学、免疫学、流式 细胞术），可回顾性分析,可确定恶性细胞的克隆 起源或鉴别良恶性细胞 FISH技术的局限性  异常检测取决于能否获得相应探针  三体检测敏感性高于单体或缺失  骨髓、外周血标本较实体瘤、石蜡切片好处理  不能检测全基因组异常（间期FISH） FISH主要仪器  FISH分析工作站（荧光显微镜、分析照相软件）  荧光原位杂交仪  恒温水浴槽  高速离心机  培养箱  微量加样器 pH仪 FISH技术比较 FISH SKY M-FISH RX-FISH CGH aCGH 全染色体扫描 × √ √ √ √ 平衡易位 √ √ 部分 × × 不平衡易位 √ √ 部分 √ √ 倒位 √ × 部分 × × 缺失 √ × 部分 √ √ 扩增 √ 部分 √ √ √ 非整倍体 √ √ √ × × 分辨率 1-10 kb 2-10 Mb 2-10 Mb 3 Mb 10-100kb FISH探针种类 着丝粒探针 位点探针 涂染探针 双色单融合探针 额外信号探针 双色双融合探针 正常 异 常 双色分离探针 数量、位点探针 人类细胞遗传学命名  nuc ish(CEP8×2)[400] nuc ish(BCR,ABL)×2[400] nuc ish(BCR,ABL)×3,(BCR con ABL×2)[380/400] nuc ish(MLL×2)[400]  nuc ish(MLL×2)(5’MLL sep 3’MLL×1)[100/200]  nuc ish(CEPX×2)[2]//(CEPX,CEPY)×1[398] A: nuc ish(ABL,BCR)×2 B: nuc ish(ABL ×2,BCR ×3) ABL BCR A ABL BCR B A: nuc ish(ABL,BCR)×3(ABL con BCR×2) B: nuc ish(ABL,BCR)×4 (ABL con BCR×3) C: nuc ish(ABL ×3,BCR ×2) (ABL con BCR×1) ABL BCR B BCR ABL A C ABL BCR TEL AML1 A: nuc ish(TEL×2,AML1×3)(TEL con AML1×1) B: nuc ish(TEL×1,AML1×4)(TEL con AML1×1) C: nuc ish(TEL×2,AML1×5) AML1 TEL/AML1 A AML1 TEL B C A B C D5S721 D5S721 D5S721 EGR1 EGR1 EGR1 A: nuc ish(D5S23/D5S721×1,EGR1×1) B: nuc ish(D5S23/D5S721×2,EGR1×1) C: nuc ish(D5S23/D5S721×3,EGR1×1) 质量控制 质量管理内容  商品探针、自配试剂验证  标准化流程及规范化操作（前处理、实验操作）  规范判读标准  建立本实验室判读阈值  建立临床生物参考区间 FISH操作流程 • 样本制备：细胞、骨髓、外周血、组织等 • 制片： 细胞悬液滴片或石蜡组织切片