定量PCR实验的关键因素Trouble Shooting.PPT

Delta-delta Ct Delta-delta Ct QIAGEN 高灵敏度高特异性试剂盒有效避免非特异性扩增 HotStar Taq — 化学修饰的热启动酶 HotStar Taq plus — 5分钟快速热启动酶 特殊缓冲液体系 — 无需优化Mg2+,退火温度 常见标准品： 线性化的质粒DNA PCR纯化产物 基因组DNA cDNA 标准品稀释及保存注意事项： 母液保存，小管分装 避免反冻融 去离子水新鲜稀释 充分振荡后移液 定量PCR实验的关键因素四 标准品的设置 GAPDH Beta-actin beta-2-microglobulin (B2M) ribosomal protein L13a (RPL13A) PPIA (Cyclophilin) ubiquitin C (UBC) eukaryotic translation initiation factors 4A (eIF4A) 18S rRNA …… 定量PCR实验的关键因素五 内参照的选择 非特异扩增 Shortened cDNA 引物二聚体 定量PCR实验的关键因素 Trouble Shooting Sybr Green法 trouble shooting第一步： 熔解曲线分析 绝对定量 4-5个不同浓度的标准品 待测样品的Ct 落在标准品Ct范围之内 斜率一般在-3.3 ~ -3.8 斜率-3.322表示PCR效率100% 斜率绝对值大于3.322，可能Ct值在非指数期或者反应有抑制 相关系数R的平方 0.99 扩增效率接近1 扩增效率1，说明可能有非特异性扩增；1说明效率未达最佳，可能条件不是最适或有抑制或酶活低 定量PCR实验的Trouble Shooting 相对定量： delta-delta CT法：首先比较目的基因和内参基因的扩增效率 取参照样品作目的基因和看家基因的5个梯度稀释，分析标准曲线的斜率 斜率差值（?M）小于0.1则扩增效率具可比性 定量PCR实验的关键因素 Trouble Shooting Rotor-Gene Q自动完成各项参数分析 某科研用户使用Rotor-Gene 进行基因表达相对定量分析 ??Ct法得出的分析结果 HouseKeeper Gene Gene of Interest Gene of Interest Housekeeping Gene 相对定量： 双标准曲线法：分析目的基因和看家基因的标准曲线，R2值，样品所在的Ct值区间等 理论上每次实验都应做一组标准曲线 实验非常稳定时也可采用导入标准曲线的方法 定量PCR实验的关键因素 Trouble Shooting 某科研用户使用Rotor-Gene 进行基因表达相对定量分析 双标准曲线法得出的分析结果 RNA的纯度和完整性是成功的关键 硅胶膜法纯化高纯度和完整性的RNA 逆转录酶和逆转录引物选择 高效的转录，并避免基因组DNA的污染 定量方法的选择，定量PCR的几大关键因素 正确的实验/引物设计，高特异性的PCR反应体系 总结 基因表达研究的完整工作流程 Automation Sample Assay 样品准备 (稳定，破碎，...) RNA 纯化 cDNA 合成 反应体系设置 定量 RT-PCR 分析 RNAlater RNAprotect Allprotect PAXgene TissueLyser RNeasy Kits RNeasy Plus Kits AllPrep Kits QuantiTect Reverse Transcription Kit FastLane Cell cDNA Kit Rotor-Gene Kits QuantiTect Primer Assays Plates QuantiTect/QuantiFast Kits FastLane Cell RT-PCR Kits GeneGlobe Pathways TissueLyser LT QIAgility Rotor-Gene Q QIAcube QIAxcel 技术支持热线： 800-988-0325 400-880-0325 * * 得到高品质RNA的前提是保持样品中RNA未降解或受外界刺激表达量上升，因此要稳定。 * 手工研磨的缺点： 费时， 尤其是处理多个样品的时候 破碎不充分，且起不到匀浆作用（降低粘稠度），导致产量、纯度下降 尤其是RNA、蛋白容易降解，手工研磨不断加入液氮麻烦，且样品容易解冻降解 结果重复性差 费时、纯度产量下降、易降解、重复性差 * * Broadest Portfolio * than 200 nucleotides. Small RNAs such as 5