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实验二、DNA凝胶电泳 实验二、DNA凝胶电泳 一、概述 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的标准方法。其中，琼脂糖凝胶分离DNA片段大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。 聚丙烯酰胺凝胶电泳主要分离小片段DNA(5-500bp), 其分辨力极高，甚至可分开相差1bp的DNA片段。 实验室中常规实验，一般用琼脂糖水平凝胶电泳装置进行DNA电泳。 实验二、DNA凝胶电泳 二、琼脂糖凝胶电泳： 1．DNA分子大小：线性DNA分子在一定琼脂糖浓度内的迁移率与DNA分子量的对数成反比。 2．琼脂糖浓度：小于0.5kb 的DNA片段所需的凝胶浓度为1.2-1.5%; 分离大于10kb 的DNA片段所需的凝胶浓度为0.3-0.7%; DNA片段大小在两者之间的所需的凝胶浓度为0.8-1.0%。 分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度 琼脂糖（%） 分离DNA片段的有效范围（kb) 0.5 1-30 0.7 0.8-12 1.0 0.5-10 1.2 0.4-7 1.5 0.2-3 实验二、DNA凝胶电泳 3、DNA分子构象：对相同分子量的质粒DNA的三种构象，超螺旋DNA移动最快，而线状双链DNA移动最慢。 4．电源电压：在低电压时，线性DNA片段的移动速率与所加电压成正比，但电压增高，不同分子量的DNA片段的移动速率将以不同幅度增加；片段越大，升高的幅度也越大。因此电压增高，琼脂糖有效分离范围将缩小。一般所加电压不得超过5V/cm. 5．染料：溴化乙啶（EB），它可嵌入堆积的碱基对之间，在紫外灯下发荧光，检测DNA的下限可达1-10ng。注意：EB是强诱变剂！ 6、离子强度：在没有离子强度时，DNA几乎不移动，在高离子强度下，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA 变性。常见的电泳缓冲液为0.5 x TBE 及0.5 x TAE, 尤其前者更为常见。 实验二、DNA凝胶电泳 三、试剂： 1、5?TBE缓冲液：Tris. 54g, 硼酸27.5g, 加入20ml 的0.5mol/L EDTA(pH8.0), 定溶至1000ml. 2、6?上样缓冲液：0.25% 溴酚兰, 40%(w/v)蔗糖水溶液。 3、溴化乙啶（EB）溶液母液：将EB配制成10mg/L，用铝 箔或黑纸包裹容器，储于温室即可。 4、DNA分子量标准： ?DNA/EcoR I/Hind III: ?DNA/EcoR I: 21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9和 2.5kb。 ?DNA/ Hind III: 23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kb. 实验二、DNA凝胶电泳 四、实验步骤 1、稀释缓冲液的制备：用蒸馏水将5?TBE缓冲液配制成0.5?TBE稀释缓冲液. 2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200ml 三角烧瓶中，进入50ml的0.5?TBE稀释缓冲液，放入微波炉或电炉加热至琼脂糖全部熔化，取出混匀。 3、胶板的制备：将二端封闭的电泳槽置于水平支持物上，插上样品梳子。在冷却至50~600C的琼脂糖胶液中加入EB溶液至终浓度为0.5?g/ml, 即10mg/ml的母液加2.5ul，混匀。小心地倒入电泳槽中至一定高度。待胶液完全凝固后拔出梳子。然后向槽内加0.5?TBE稀释缓冲液至液面刚好没过胶板表面。 实验二、DNA凝胶电泳 4、加样：取2-5?l样品加1?l 的6?上样缓冲液， 用移液枪混匀（在Parafilm膜上操作），小 心加到样品槽中。同时加DNA分子量标准对照。 5、电泳：从负极到正极，60-80V, 电流40mA以 上。 当溴酚兰条带移动至距凝胶前沿约2cm 时，停止电泳。 6、观察和拍照：在波长为254nm的紫外灯下，观 察DNA电泳带并估计其分子量大小。同时可用 加红色滤光片和近摄镜片的相机拍照（光圈 5.6下暴光10-120秒）。 * * 在0.5X TBE 缓冲液中，溴酚兰相当于 300bpDNA, 二甲苯氰FF相当于 4000bp DNA.