日本沼虾Macrobrachiumnipponense卵黄蛋白原代谢相关基因的克隆和表达研究.docVIP

日本沼虾（Macrobrachium nipponense）卵黄蛋白原代谢相关基因的克隆和表达研究 【摘要】：日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)又名青虾、河虾,是我国重要的经济淡水虾。近年来,随着其自然资源的锐减和养殖规模的扩大,养殖的日本沼虾出现了生产性能下降和种质资源退化的情况,其中虾个体小型化和“性早熟”的现象尤为突出。“性早熟”即雌、雄性个体性腺提前发育,造成了商品虾的规格降低,繁殖性能下降,严重影响了日本沼虾的品质和产值,成为日本沼虾养殖业发展的一大瓶颈。与精巢相比,卵巢发育需要消耗更多的营养,使得雌性个体的“性早熟”对日本沼虾的养殖业产生的负面影响更大。造成雌性个体“性早熟”的原因尚未完全查明,有学者从养殖外部环境条件和营养调控的角度进行了探讨,但均未涉及到卵巢发育提前启动,即雌性“性早熟”的机理,查明虾的卵巢发育机制将为解决这一生产难题提供理论基础参考。甲壳动物卵巢发育过程中最显著的变化是卵母细胞直径的剧烈增大,这主要是由于卵巢内卵黄蛋白(yolkprotein)等营养物质大量积累所致。甲壳动物卵黄蛋白的前体物质卵黄蛋白原(vitellogenin,Vg)在卵子发育之初即启动合成,合成后在体内被水解为卵黄蛋白沉积在卵母细胞中。有关甲壳动物Vg的合成和水解过程的影响和调控机制至今不十分清楚,但卵生脊椎动物这一过程的研究已做了大量细致的工作。卵生脊椎动物Vg的合成受体内外多种激素和多肽的调控,其中热休克蛋白90(heatshockprotein90,HSP90)和环境类雌激素双酚A(BPA)和雌激素受体结合,诱导体内Vg合成,Vg合成后在水解酶的作用下水解为卵黄蛋白,组蛋白酶L(canthepsinL,CL)和组蛋白酶B(canthepsinB,CB)在这一水解过程中发挥着重要的作用。本研究借助分子生物学和生物信息学手段,首次克隆获得日本沼虾Vg基因cDNA片段、HSP90、CL和CB基因cDNA全长,分别命名为MnVg、MnHSP90、MnCL和MnCB。并测定了上述基因在日本沼虾不同组织中、卵巢发育过程中及不同剂量BPA浸泡暴露下mRNA表达量的变化。研究结果将为阐明日本沼虾“性早熟”的产生过程,以及采取有效的控制手段提供必要的参考。主要研究结果如下：1、克隆获得567bp的日本沼虾MnVg片段,该序列共编码183个氨基酸；这183个氨基酸序列与罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)Vg蛋白的相似性高达95%,与朝鲜长额虾(Pandalushypsinotus)、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)、日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)、刀额新对虾(Penaeusmonodon)Vg蛋白的相似性分别为76%、52%、52%、51%；不同组织实时荧光定量PCR(qPCR)结果显示：MnVgmRNA在日本沼虾鳃、肌肉、血细胞、心脏、胸神经节和肠中均有表达,胸神经节中的表达量最高；卵巢和肝胰腺中Vg表达量随着卵巢的发育逐步升高,当卵巢发育至次级卵黄发生期(期)时MnVg的表达量达到最大值,而且在卵巢发育过程中肝胰腺内MnVg的表达量显著高于卵巢内的表达量(p0.05)。上述结果表明：日本沼虾MnVg合成既有内源性又有外源性,且以外源性的合成为主,肝胰腺是日本沼虾MnVg的主要合成器官。2、动物受到外界刺激,如热刺激等,体内HSP90会大量合成,但是近年来的研究结果表明,HSP90不仅与热休克等刺激有关,而且在卵生脊椎动物的卵巢发育过程中也具有重要的作用。雌二醇缺乏时,HSP90和雌二醇受体结合,从而促进Vg蛋白合成。本研究应用简并引物通过RACE法成功克隆了日本沼虾MnHSP90基因cDNA全长序列。该序列全长2,684bp,其中包括126bp5’-UTR,2,199bpORF和359bp3-UTR(序列号：GU319963),ORF编码732个氨基酸,该蛋白的分子量为84.3KDa。序列比对结果显示MnHSP90氨基酸序列与其它动物HSP90氨基酸序列具有很高的相似性(72%-79%)。qPCR测定结果显示,MnHSP90基因在日本沼虾胸神经节中表达量最高,显著高于其它组织(肌肉、肠、鳃和血细胞)(p0.05),为其他组织的2-10倍；不同组织中,肌肉、肠、鳃中的表达量均较高,显著高于雌虾和雄虾血细胞中的表达量(p0.05)。卵巢和肝胰腺中的MnHSP90表达量随着卵巢发育逐步升高,分别在初级卵黄发生期(期)和次级卵黄发生期(期)达到最大值。在卵巢整个发育过程中,肝胰腺中的MnHSP90表达量显著高于卵巢(p0.05)。上述结果不仅表明MnHSP90与日本沼虾的卵巢发育有关,而且进一步证明了肝胰腺是日本沼虾卵黄蛋白原主要的合成器官,同时