毛细管电色谱快速分离核苷.PDF

毛 细 管 电 色 谱 快 速 分 离 核 苷 概述：本实验研究了用苯基键合硅胶毛细管电色谱分离五种核苷混合物时几种实验参数（ PH 值、电离 强度、水 - 有机物缓冲液中有机改性剂的含量）对电渗流（EOF ）、保留时间、保留因子的影响。本文 说明了CEC 作为一种解决复杂的中性和可电离溶质混合物分离的方法和短柱进样可作为一种减少分离时 间的方式。 关键词：毛细管电色谱、核苷、短柱进样、苯基键合硅胶 1. 介 绍 ： 毛细管电色谱（CEC ）是一种体现了LC 和 CE 两者特征的方法。它的应用随着CEC技术和设备的 成熟而得到加强。现在CEC设备能提供在线检测和高容量的自动进样器，并具有可重复纳升级低的进样 能力。 CEC主要的应用同 CE 和 LC 相似。到现在为止，大多数CEC 的应用主要集中在中性粒子的分 离，但现在的研究也包括酸性和碱性物质的分离。然而，CEC分离碱性物质存在问题，因为碱性物质同 电离的硅烷基间的强吸附反应作用而导致了严重的峰拖尾。Smith 和Evans 建议采用强阳离子交换固定 相，但 Euerby 则报道了用该系统会导致不可重现的数据和严重的峰拖尾。臧研究了一些碱性物质和核 苷在十八烷基磺化硅胶微粒填充的硅胶柱上的保留行为。最近，Helboe 和Hansen证明了在CEC C18硅胶 柱上分离核苷，可通过加入三乙胺来最小化吸附反应作用。最后，Cikalo 报道了用C18 键合硅胶柱得到 不好的峰形，使用苯基键合硅胶柱会改良这一现象。 我们研究的目的是CEC 中使用易挥发的缓冲液，中性和电离的核苷在苯基硅胶固定相上的电泳行 为。更进一步，我们使用了短柱进样以减短分析的时间。 2. 材 料 和 方 法 ： 2.1 毛细管电色谱设备： CEC 在一台P/ACE2100 （Beckman-Coulter, Fullerton, CA, USA ）设备上操作，在我们的实验室里用浆 液填充法填充长 20cm ，内径75um 和长 7cm , 内径75um 的柱子，如前面文献提到的方法。Hypersil 苯基固定相由Colochrom ( Gagny, France ) 提供，该固定相颗粒平均直径为3um ，平均孔隙直径为 2 120Å ，比表面积为170m /g ，未被覆盖。柱子的填充在压力为400bar 下用泵泵入3um 的浆液 （100mg/ml 溶于甲醇中）一个小时（乙醇用做填充溶剂）。柱塞通过用一台加热的电线剥离器烧结固 定相制得。填充后，毛细管柱通过一手动注射泵泵入流动相进行预处理，压力为500psi 。柱子被安装在 P/ACE 设备上，并用5KV 电压驱动流动相通过柱子30min ，然后再用10KV 和 15KV 电压驱动30 min 。 在预处理过程中，使用的流动相为草酸/ 氨缓冲液，其中包含80% （v/v ）的乙腈, 洗脱液的电离强度 为10mM 。 每种缓冲液的 PH 值均由Beckman PH 计检测，洗脱液的制备首先在加入有机改性剂前调节含水缓冲 液的PH 至所需要的值。 物质用电动进样方法进样（10KV/4s ）。分离的温度（ 20°C ）通过让毛细管浸入一通循环冷却液体 的夹套得以控制。物质在254nm 被检测。缓冲液的制备由Phoebus 软件控制，这个软件可用于检测大量 的缓冲液的化学性质、带电性质和电泳特性，并可以用储存的溶质来制得所需要的缓冲液。EOF通过检 测硫脲的洗脱时间来检测。 3 结 果 和 讨 论 ： 本研究选择了五种核苷的混合物：腺苷（A ）、胞苷（C ）、鸟苷（G ）、尿苷（U ）、胸苷（T ）。 3.1 PH 值的影响： 在CEC 中，液相是靠电渗流（EOF ）驱动通过柱子的，流动的原理是在液- 固表面形成一双电层。在硅 胶颗粒填充的柱子里，毛细管壁是带负电的，因为硅烷基的分解，因此溶质的表面带正电（由于溶质的 电离）。当在柱子内形成电场后，离子向阴极移动，形成了一条溶质束。因此EOF 的大小取决于毛细管 壁和固定相的带电密度。正如所预想的，EOF在碱性 PH 值下会增大，由于硅烷基的电离，因此如同 CE 一样，EOF在苯基硅胶柱上 PH 从3 到6 是会增加50% 。 另外，流动相的PH 值对核苷的保留和洗脱次序会有很大 的影响。图1 显示了在几种PH 值下核苷的