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令绝曼! 女性激素对子宫内膜细胞GJIC影响的体外研究 摘要 周期性变化的调节，同时，也可能是子宫内膜增殖性病变发生发展的机制之一。 细胞在发生过度增殖过程中，发生GJIC功能紊乱和下降，细胞间接触抑制 作用的丧失，是导致癌变的不可忽视的重要因素。有研究表明，促癌剂可抑制 GJIC功能，抑癌剂则使GJIC功能恢复。Cx的表达可影响GJIC的功能，例如： 高糖能降解视黄醛内皮细胞Cx43的表达，导致GJIC功能的下调；促黄体生成 激素能降低体外培养的卵巢颗粒细胞Cx43的表达及GJIC功能：芹黄素及福桔 黄索能提高大鼠肝上皮细胞Cx43的表达及GJIC功能。Cx表达异常与细胞异常 增殖和癌变相伴随，例如：肝癌组织中Cx32表达量较正常肝组织显著下降；宫 达缺失；子宫内膜腺癌Cx43、Cx32呈现低表达。将连接蛋白基因转染到肿瘤细 胞后，发现被转染的细胞GJIC功能增强，恶性表型降低。 间隙连接通讯的作用后，开始有学者进行各种因素对体外培养细胞GJIC的功能 及Cx的影响的研究。大多数关于Cx的研究认为，Cx表达下调会导致细胞的过度 增殖；亦有部分研究发现Cx异常分布于胞浆中或具有功能的磷酸化Cx减少或消 失或分布异常也将导致GJIC的功能下降或丧失。目前，有许多检测连接蛋白方 法，用于推澳tJGJIC的功能，而GJIC的功能与连接蛋白的磷酸化状态密切相关， 因此，现有的免疫组化法、免疫印迹法检测到的连接蛋白的总量变化，可能不能 完全反映GJIC的功能改变。 本课题拟通过正常子宫内膜细胞的体外培养，研究两种促子宫内膜增殖激素 雌二醇和雌酮及临床上常用的抗子宫内膜增殖激素一左炔诺孕酮对体外培养的 子宫内膜间质细胞及腺上皮细胞的增殖及凋亡的影响；进而研究它们对子宫内膜 细胞间隙连接通讯功能的影响，以及它们对子宫内膜细胞Cx43、Cx32表达的影 响：探讨女性激素对子宫内膜GJIC影响的全貌，同时为探索子宫内膜异常增殖 的发生机制以及寻找新的防治措施提供研究依据。 材料与方法 1．细胞培养： 选择2003年6月至2004年3月在中山二院妇产科因子宫肌瘤行全子宫切除 的患者22例，术前3个月未用激素，月经周期规律(28～32d)。术中获取子宫 lI ◇皱型! 女性激素对子宫内获细胞GJIc影响的体外研究 摘要 ml 内膜，之后立即投入盛有5 PBS的无菌青霉素瓶内，低温条件下迅速转移到 实验室进行分离培养。术后病理诊断未发现子宫内膜存在病变。子宫内膜间质细 胞属于成纤维细胞型，腺上皮细胞属于上皮细胞型，它们都属于贴附生长型细胞。 本研究根据成纤维细胞细胞具有快速贴壁而上皮细胞贴壁较慢的特性，改良了传 统的仅用酶消化、过滤的方法，加用选择性贴壁分离法，分离培养原代子宫内膜 腺上皮细胞及间质细胞，预实验结果显示可获得比传统方法更高的细胞纯度。并 用角蛋白及波形蛋白抗体进行细胞纯度鉴定。 2．MTT法检测： 细胞增殖活性的影响，并用表皮生长因子(EGF)作为阳性对照(n=20)。 3．DNA切口末端标记法(TUNEL)检测： LNG、E2、E1对子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞凋亡的影响(n=6)。 4．流式细胞检测法检测： LNG、E2、E1对子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞生长周期的影响(n=10)。 5．划痕荧光标记法检测： 连接通讯功能的影响(n=6)。 6．激光共聚焦扫描显微镜检测： 达的影响(n=12)。 结果 1．子宫内膜细胞培养情况： 改良方法培养的原代细胞活性高。免疫组织化学鉴定子宫内膜间质细胞波形 蛋白染色阳性，角蛋白阴性，纯度率约(97．89±0．96)％；子宫内膜腺上皮细胞 中，波形蛋白染色阴性，细胞角蛋白染色阳性，阳性率达(95．12±2．It)％。间 质细胞可以有限传代10～20代，腺上皮细胞能传1~2代。 2．左旋炔诺孕酮、雌二醇、雌酮对子宫内膜细胞增殖活性影响： El各浓度对子宫内膜细胞没有明显促进增殖作用，5×10‘5mol／LEl抑制细胞 III Q纨苎童 女性激素对子宫内膜细胞GJIc影响的体外研究 摘要 腺上皮细胞增殖(