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实验九 柱层析分离邻硝基苯胺与对硝基苯胺 1. 柱层析 (柱色谱 Column Chromatography, CC) Chromatography, from Greek chroma, color and graphein to write, that is, color writing. Column chromatography in chemistry is a method used to purify individual chemical compounds from mixtures of compounds. It is often used for preparative applications on scales from micrograms up to kilograms. 1.2 吸附剂 (Adsorbent) 常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、氧化镁、碳酸钙、活性炭、纤维素等。实验室一般用硅胶或氧化铝。 柱层析硅胶100-200 目(mesh) 1.3 淋洗剂 (Eluent) 常用溶剂的洗脱能力： 水乙酸甲醇乙醇丙酮乙酸乙酯二氯甲烷石油醚 柱层析用于制备目的的分离或纯化，从几十毫克到数十克，工业规模可达数公斤。 1.4 柱层析应用 混合物分离，可用极性不同的淋洗剂淋洗，一般是极性先小后大（改变不同极性溶剂的比例），此为梯度淋洗 (gradient elution)。 3. 实验步骤 Procedures 3.1 装柱 将层析柱洗净、干燥，垂直固定，下接锥形瓶。 准备: 取硅胶 (100-200 mesh) 10 g，加石油醚30 mL，搅拌均匀，调成糊状。向柱内加入石油醚10 mL(至约柱高1/3)。打开 旋塞，将调好的石油醚-硅胶-通过漏斗加入，并轻敲柱体，至硅胶全部装完。 湿法装柱 装柱过程中，维持一定高度的溶剂层，不得露出硅胶表面. 柱装得应均匀、密实，无断层、裂缝、暗沟或气泡，硅胶表面水平。 3.2 上样 当溶剂层液面刚好下降至硅胶表面时，关上旋塞，用滴管沿柱内壁加入邻硝基苯胺与对硝基苯胺溶液 (2 x 0.05 M) 2 mL.打开旋塞，当液面刚好下降至硅胶表面时，关上旋塞，用少量石油醚冲洗，再打开旋塞，当液面刚好下降至硅胶表层面时，再关上旋塞。至此，完成上样。 上样后加脱脂棉覆盖硅胶表面。 注意使溶剂始终覆盖硅胶表面。 3.3 淋洗 用两种不同极性的淋洗剂淋洗 I. 4:1 (V/V) 石油醚-乙酸乙酯 50 mL (40 + 10 mL) 淋洗 黄色带——邻硝基苯胺，用100 mL 锥形瓶接受。 若无中间空白带则要换接受瓶。 II. 2:1 (V/V) 石油醚-乙酸乙酯 54 mL (36 + 18 mL) 淋洗 淡黄色带——对硝基苯胺，应换接受瓶 (100 mL锥形瓶)。 注意洗脱过程中不得淋干。 淋洗过程可用TLC跟踪。 3.4 除溶剂 用旋转蒸发仪除去溶剂，挥发至干得纯组分邻硝基苯胺与对硝基苯胺。 可用TLC 检验其纯度，计算Rf值。 展开剂: 石油醚-乙酸乙酯 (2 : 1 V/V) 3.5 重结晶 邻硝基苯胺与对硝基苯胺均可用水重结晶，得橙黄色的邻硝基苯胺晶体与黄色的对硝基苯胺晶体。 Notes 1. 流出的溶剂循环使用，使硅胶全部加入。装填吸附剂期间，维持较高的液面为宜。装柱好坏直接影响分离效果。理想的柱应是均匀、密实，无断层、裂缝、暗沟或气泡，吸附剂表面水平。否则，可能导致色带不能水平下移、前后交叉而达不到分离效果。 2. 上样是一次加入，待液面下降至硅胶表面时再用少量石油醚冲洗，可重复2~3次，溶剂用量尽量要少。上样冲洗后待液面下降至硅胶表面时，关上旋塞，准备加淋洗剂。 3. 加脱脂棉作为保护层以防破坏硅胶表面水平。最好加海砂。 4. 装柱、上样或淋洗过程中，不得露出硅胶表面。否则，可能导致裂缝而影响分离效果。 整个黄色带用一个接受瓶接受。若中间的空白带明显，用 两个接受瓶即可。否则，中间带应用另一接受瓶接受。 梯度淋洗，应待前一种极性较小的淋洗剂液面刚好下降至 吸附剂表面时，再加入后一种极性较大的淋洗剂。 由于浓度较低，应重复点样（2-3次即可），与样品混合液 对点。展开剂：石油醚-乙酸乙酯 (2:1 V/V) 旋干溶剂，可能看到纯组分邻硝基苯胺与对硝基苯胺晶体。 旋去大部分溶剂再点板，效果更好，即使含量甚微的杂质 也可能显示出来。 邻硝基苯胺与对硝基苯胺均可用水重结晶，得橙黄色的邻 硝基苯胺晶体与黄色的对硝基苯胺针状晶体。由于量太少， 不便过滤，不要求重结晶。若重结晶