人Th1 Th2与Tc1 Tc2的检测.pdfVIP

联科生物技术有限公司 全国免费电话：800 8571 184 传真：0571-8816 3303 第三部分 人Th1/Th2和Tc1/Tc2的检测 1．检测原理 Th1 和Th2 细胞均分泌多种细胞因子: l Th1 细胞主要分泌IL-2 、IL- 12、IFN- γ和TNF- β/ 等; l Th2 细胞主要分泌IL-4 、IL-5、IL-6 和IL- 10 其中 IFN- γ为 Th1 最特异分泌的细胞因子，IL-4 为 Th2 最特异分泌的细胞因子。虽然人们一直在努 力寻找区分Th1 与Th2 的特异性的细胞表面标志，但迄今为止，还没有找到公认的细胞表面鉴别标志， 所以仍以所分泌的细胞因子来区分Th1 与Th2 ，即： Th1 ：CD4+IFN- γ+, Th2 ：CD4+IL-4+ 同理，Tc1 和Tc2 也需用IFN- γ和IL-4 来区分，即： Tc1：CD8+IFN- γ+, Tc2 ：CD8+IL-4+ 其实，我们通常所说的Th1 和Th2 是指T 辅助细胞(严格意义上是Th0 细胞)在各种生理与病理条件下 分化为Th1 和Th2 的能力。静息状态( 即未受任何刺激，如人的正常生理状态)下，Th0 分化为Th1 和Th2 的能力非常弱，所以外周血中仅含有极少量的Th1 和Th2 细胞，这时我们所能检测到的IFN- γ和IL-4 也 微乎其微。而当Th 细胞受到外界因素，如刺激素，病原体等刺激，其中Th0 即会向Th1 或Th2 大量分化， 具体分化趋向取决于细胞因子的种类。此时，我们检测到的IFN- γ或IL-4 也较多。实验中我们检测的Th1 和Th2 实际上是检测Th 细胞对刺激素刺激的反应能力。 我们通常选用的刺激素为PMA(佛波酯)+ Ionomycin(离子霉素) 。 其中PMA 为PKC( 蛋白激酶C) 的激活物，PKC 则可激活下游众多的蛋白激酶的磷酸化，形成级联反 应，导致许多蛋白的表达，进而引起T 细胞的活化。在细胞内，PKC 可被DAG(二脂酰甘油)和Ca2+的共 同作用而激活，因此在Ionomycin(Ca2+ 的转运剂，可将细胞器内的Ca2+转运至胞浆内) 的参与下，T 细胞 内PKC 可被进一步激活。可见，PMA 与Ionomycin 协同活化T 细胞。 也有人选用其它刺激剂来活化T 细胞，如CD3/CD28 协同刺激，PHA 刺激等。实验表明，PMA 为广 谱性刺激，即T 细胞中的各亚群均会被PMA 同等激活，而CD3/CD28 协同刺激和PHA 刺激，则是通过 TCR 受体的作用，仅对部分T 细胞亚群有效。所以可根据实验的需要来选择刺激方式。 活化的T 细胞可分泌多种细胞因子至细胞外，而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原，所以应阻断细胞 16全国免费电话：800 8571 184 联科杭州：0571-8816 3118 联科上海：021-6451 1079 联科北京：010-5180 5911 联科苏州：0512-6866 6623 联科厦门：0592-5322 2277 联科广州：020-8350 6317 联科武汉：800 8571 184 联科南京： 025-8660 9294 16 联科生物技术有限公司 全国免费电话：800 8571 184 传真：0571-8816 3303 因子分泌至细胞外。方法为破坏高尔基体(Golgi) ，因细胞因子( 即各种蛋白)在合成后需经高尔基体的加工 和转运，才能到达细胞膜，然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。因此破坏 高尔基体即可切断细胞因子的转运途径，干扰其分泌。我们通常选用的阻断剂为BFA 或Monensin, 其中 BFA 的阻断效果优于Monensin, 但由于前者价格较昂贵，现实验中多用Monensin 来替代BFA. 另外，实验过程中涉及到如何正确的选定 Th( 即 T 辅助细胞) 的问题。 Th