第四章蛋白质与dna的相互作用dna结合蛋白的检测和纯化dna结合 .pdf

第四章蛋白质与DNA 的相互作用 DNA结合蛋白的检测和纯化 DNA结合蛋白的基本结构域 蛋白质与DNA结合的特性 蛋白质与DNA 的普遍性结合 蛋白质-DNA特异性识别的模型 非特异性DNA结合蛋白的结合 蛋白质与DNA特异性结合的复合物 DNA结合蛋白的检测和纯化 亦称凝胶移动变化测定(gel mobility shift assay-GMSA or band shift assay), 可以鉴定DNA与蛋白质结合的情况，将标记的DNA 小片段与蛋白质混合进行PAGE 电泳，不结合蛋白质的DNA泳动 较快，结合蛋白质的DNA则滞留而缓慢移动。 足迹法分析DNA上蛋白质结合位点 即DNA footprinting, DNA结合蛋 白质后不被 DNase酶 切，标记一 条链末端， 电泳分析可 鉴定DNA蛋 白质结合部 位。 亲和层析法纯化结 合蛋白 足迹法和序列测 定DNA 的蛋白质结 合部位后人工合成 结合部位顺序，结 合到不溶性琼脂糖 等介质(凝胶柱) ， 细胞蛋白提取物通 过时被结合而进一 步得到纯化。 DNA结合蛋白的基本结构域 螺旋-转折-螺旋(Helix-turn- helix, HTH) 含两个α-螺旋由一 段大弯曲连接(15~20个氨基 酸残基) ，其一称识别螺旋 正好与DNA特异顺序上的大 沟或小沟吻合可结合到DNA 的沟槽中，而另一螺旋与部 分DNA序列互作起支持和稳 定识别螺旋的作用。调节蛋 白中通常有两个Helix-turn- helix形成二聚体（dimers ） 正好插入DNA上相邻的两个 大小槽内，多数是大槽。 锌指结构(Zinc finger motif) 由约30个氨基酸组成， 含两个胱氨酸和两个组氨酸 或有时是4个胱氨酸与锌原 子构成四部分复合物将氨基 酸链拉成指头状的环 （loop ），可伸展到DNA大 槽上的碱基边缘产生互作。 含锌指结构的调节蛋白通常 有2-10个锌指，与相邻DNA 区段互作。大约有200多种 调节蛋白含锌指基序是最普 遍的DNA结合结构，锌亦可 稳定其它DNA结合蛋白。 锌指结构 大约有200多种调节蛋白 含锌指基序是最普遍的DNA结合 结构，锌亦可稳定其它DNA结合 蛋白。锌指蛋白为两条反平行β- 折叠和一个α-螺旋组成，β-折 叠的两个Cys残基于α-螺旋的两 个相近His残基与Zn配位结合形 成锌指结构。一些非保守的残基 决定每一区域的特异性。多数蛋 白含多锌指结构域。 锌指结合于DNA大沟，与 5bp序列呈平行结合。 亮氨酸拉链(Leucine zipper) 由两条相同或不同的肽段上两个α螺旋（helix ）组 成的卷曲螺旋（coil ），由一系列间隔7个氨基酸的亮氨酸残 基靠疏水作用形成，端部的两个α螺旋由leucine zipper将其 插入DNA 的两个大槽内。含leucine zipper调节蛋白在正常细 胞中行使重要