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人组织蛋白酶 K(Cath-K)酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书
人组织蛋白酶K(Cath-K)酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断!
预期应用
ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中Cath-K含量。
实验原理
用纯化的Cath-K抗体包被微孔板,制成固相载体,往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的Cath-K
抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物(TMB)显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,
并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的cath-K呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测
定吸光度( 值),计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1、 酶标板:一块(96孔)
2、 标准品(冻干品): 2瓶,请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至0.5ml,盖好后室温静
置大约10分钟,同时反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为1,000 pmol/L,然后做系列倍比稀释(注:不要
直接在板中进行倍比稀释),分别配制成1,000 pmol/L,500 pmol/L,250 pmol/L,125 pmol/L,62.5 pmol/L,
31.2 pmol/L,15.6 pmol/L,样品稀释液直接作为空白孔 0 pmol/L。如配制500 pmol/L标准品:取0.3ml
(不要少于0.3ml )1,000 pmol/L的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,
其余浓度以此类推。
3、 样品稀释液:1×20ml。
4、 检测稀释液A:1×10ml。
5、 检测稀释液B:1×10ml。
6、 检测溶液A:1×120 /瓶(1:100)。临用前以检测稀释液A 1:100稀释(如:10 检测溶液A / 990
检测稀释液A),充分混匀,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(100 /孔),实际配制时
应多配制 0.1-0.2ml。
7、 检测溶液B:1×120 /瓶(1:100)。临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。
8、 底物溶液:1×10ml/瓶。
9、 浓洗涤液:1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10、终止液:1×10ml/瓶(2 mol/L H2SO4)。
11、覆膜:5张
12、使用说明书:1份
自备物品
1、 酶标仪(建议仪器使用前提前预热)
2、 微量加液器及吸头,EP管
3、 蒸馏水或去离子水,滤纸
标本的采集及保存
1、 血清:全血标本请于室温放置2小时或4 过夜后于1000 g离心20分钟,取上清即可检测,或将上清
置于-20 或-80 保存,但应避免反复冻融。
2、 血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于 1000 g离心15分钟,取上清即可检测,
或将上清置于-20 或-80 保存,但应避免反复冻融。
3、 其它生物标本:请1000 g离心20分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20 或-80 保 存,但应
避免反复冻融。
注:以上标本均应密封保存,4 保存应小于1周,-20 不应超过1个月,-80 不应超过2个月;标本溶血
会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。
操作步骤
实验开始前,各试剂均应平衡至室温,试剂不能直接在37 溶解;试剂或样品配制时,均需充分混匀,混
匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量,如样品浓度过高时,应对样品进行稀释,以使稀释后的样品
符合试剂盒的检测范围,计算时再乘以相应的稀释倍数。
1、 加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100 ,余孔分别加标准品或待测
样品100 ,注意不要有气泡,加样 时将样品加于酶标板底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板
加上盖或覆膜,37 温育2小时。为保证实验结果有效
性,每次实验请使用新的标准品溶液。
2、 弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100 (临用前配制),酶标板加上覆膜,37 温
育1小时。
3、 弃去孔内液体,甩干,洗板 3次,每次浸泡1-2分钟,大约400 /每孔,甩干(也可轻拍将孔内液体
拍干)。
4、 每孔加检测溶液B工作液(临用前配制)100 ,加上覆膜,37 温育1小时。
5、 弃去孔内液体,甩干,洗板5次,方法同步骤3。
6、 每孔加底物溶液90 ,酶标板加上覆膜37 避光显色(反应时间控制在15-30分钟,当标准孔的前3-4
孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔梯度不明显时,即可终止)。
7、 每孔加终止溶液50 ,终止反应,此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物 液的加入
顺序相同。
8、 立即用酶标仪在450nm波长测量各孔
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