免疫荧光技术.ppt

细胞爬片免疫荧光实验流程 1. 细胞爬片的制作； 2. 固定（4%的多聚甲醛）； 3. 细胞膜通透（0.5%Triton X-100，20min）； 4. 封闭（6%山羊血清，30min）； 5. 一抗孵育（一抗浓度，湿盒，4℃过夜，PBS漂洗）； 6. 二抗孵育（二抗种属，湿盒，室温1h，避光，PBS漂洗）； 7. 复染核（DAPI，避光，5min，PBS漂洗）； 8. 封片（荧光淬灭剂的封片液）； 9. 荧光显微镜下观察采集图像。 1. 细胞的固定 【固定的定义】 将新鲜的活体组织或细胞，立即加入固定液中，以此使细胞保持原有形态、结构的一种方法。 【固定的意义】 1、组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，原位保存抗原，避免抗原失活或弥散。 2、停止细胞中的生化反应，固定其中的各种生化物质状态，防止细胞死亡后出现自溶分解。 3、使细胞中蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持生前形态。 4、固定细胞形态，防止其变形或破裂。 5、使组织内各种物质产生不同的折光率，便于观察和鉴定。 6、使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。 免疫荧光实验流程中一些注意事项 【固定液的选择】 2、冰冻切片制备： 建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。 选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。 3、血清封闭： 为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。 封闭是血清与非特异性位点结合，以消除非特异性染色，提高目的蛋白的准确性和降低背景。 血清封闭的时间是可以调整的，一般30min。 4、一抗孵育条件： 在免疫荧光实验中最重要，包括孵育时间和抗体浓度； 一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳； 孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min； 具体条件还要摸索。 6、复染： 目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位； 一般常用DAPI复染。 7、封片： 为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液； 避免产生气泡。 5、二抗孵育条件： 二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索； 而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度； 切记要避光反应； 但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间； 最后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。 8、切片清洗： 为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间 和增多次数）尤为重要，一般在一抗的清洗是5min*3次； 注意（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。 （2）温柔冲洗，防止切片的脱落； （3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。 （4）PBS的PH和离子强度的使用和要求，建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。 （中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解； 低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解） 9、拍照： 封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度； 正确使用荧光显微镜，防止紫外线对眼睛的损害； 检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以最多不得超过2~3h； 荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃，一天中应避免数次点燃光源，关闭汞灯至少在开启15-30分钟后； 时效性：标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发； 使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油； 电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。 免疫荧光技术常见问题 1、石蜡切片和冰冻切片的比较？ （1）要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。 （2）冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫荧光时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片