第7章原生质体培养和体细胞杂交试卷.ppt

番茄+马铃薯 第三节、原生质体融合 二、融合方法 无机盐诱导融合 高pH-高Ca离子 聚乙二醇(PEG)法 PEG结合高钙-高pH诱导法 电融合技术 第三节、原生质体融合 (一)无机盐诱导融合: NaNO3法 1972年： Carlson诱导原生质体融合获得首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。 NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原 生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起 不足：诱导频率不高。 第三节、原生质体融合 1973年：Keller用pH10.5的50 mM CaCl2溶液在37℃时，诱发烟草叶肉原生质体融合。 优点：杂种产量高。 不足：高pH值对细胞有毒害作用。 第三节、原生质体融合 （二）高pH-高Ca离子法 PEG法特点： 融合频率高 可重复性强 诱发融合无特异性 毒性较低 植物+植物 植物+动物 动物+酵母 Polyethylene Glycol（聚乙二醇） 第三节、原生质体融合 （三）PEG法 PEG法原理 PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。 第三节、原生质体融合 PEG法示意图 第三节、原生质体融合 - + - 桥梁 + - PEG被洗掉 + - + - 电荷重排 + - + - + - + - 膜接触 最为常用。 具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质体----滴加PEG溶液，摇匀，静置---滴加高钙-高pH溶液，摇匀，静置---滴加原生质体培养液洗涤数次---离心获得原生质体细胞团---筛选---再生杂合细胞 第三节、原生质体融合 （四）PEG结合高钙-高pH诱导法 (五)电融合技术 Senda 1979年首先用此方法实现原生质体融合 细胞融合仪 第三节、原生质体融合 电融合法原理 交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠。 + - 负极 正极 + - + - + - + - 第三节、原生质体融合 + - + - + - + - 施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。 第三节、原生质体融合 + - + - + - + - + - + - + - + - 原生质体的融合过程： 第三节、原生质体融合 三、体细胞杂种细胞筛选与鉴定 1．互补选择法 第三节、原生质体融合 2、机械分离杂种细胞法 3. 双荧光标记选择法 异硫氰酸荧光素（FITC）：绿色 异硫氰酸罗丹明（RITC）：红色 3. 双荧光标记选择法 第三节、原生质体融合 第三节、原生质体融合 四、体细胞杂种植株的鉴定 形态学鉴定 细胞学观察 DNA内切图谱分析 同工酶分析 第三节、原生质体融合 4-1、形态学鉴定 第三节、原生质体融合 4-2、细胞学观察 染色体形态和数目的比较 18条染色体 36条染色体 第三节、原生质体融合 4-3、 DNA内切图谱分析 RAPD带型 （随机扩增的多态性DNA） 第三节、原生质体融合 (1) 原生质体培养的意义：(1)再生植株； (2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。 (2) 原生质体分离方法：机械分离法、酶法分离。 (3)酶的种类及特点 (4)原生质体的纯化方法：离心沉淀法；漂浮法；界面法。 (5)原生质体活力的测定：形态识别；染色识别。 第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交 本章小结： （6）原生质体培养方法：液体浅层培养；平板法培养；悬滴法培养；双层培养法；饲喂层培养 （7）原生质体融合的方法：无机盐诱导融合；聚乙二醇与高pH高钙相结合的诱导融合；电融合技术。 （8）杂种细胞的筛选与鉴定：互补选择；机械分离杂种 细胞法；双荧光标记选择法 （9）杂种植株的鉴定：形态学鉴定；细胞学观察；DNA内切图谱分析；同工酶分析 第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交 本章小结： 兰花 第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * * 植物组织培养 Good Morning 第7章 原生质体培养与 体细胞杂交 原生质体的分离与纯化 原生质体培养 原生质体融合 第7章 原生质体培养