【名称】β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶.PDFVIP

【名称】 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶 【英文名】 【别名】 【概述】 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶 (NAG)可水解 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷，也能水 解β-N-乙酰氨基半乳糖苷。该酶广泛存在于各种组织器官、体液、血细胞 中，是溶酶体中的一种酸性水解酶。其测定方法有比色法和荧光光度法。 【原理】 (1)对硝基酚比色法：NAG 可使底物对硝基酚-N-乙酰-β-D 氨基葡萄糖水 解，释放出游离的对硝基酚，在碱性溶液中显色，其颜色深浅与酶活力有关。 (2)荧光光度法：NAG 可使荧光底物4-甲基伞形酮 N-乙酰 β-D-氨基葡萄糖 苷水解，释放出游离的 4-甲基伞形酮 (4-MU)，后者在碱性条件下变构，受激发 产生荧光，其荧光强度可反映酶活性。 【试剂】 (1)对硝基酚比色法：
  ①50mmol/L枸橼酸盐缓冲液 (pH4.6)：称枸橼酸(CH O ·HO)5.4g，枸橼酸
C H O ·2H O)10g，用蒸馏水溶解后稀释至 1000ml。 三钠 (Na ②10mmol/L底物缓冲液：称对硝基苯N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷 342.3mg，用上述缓冲液稀释至 100ml，混匀，4℃冰箱可保存 10天。    ③50mmol/L硼砂-氢氧化钠缓冲液 (pH9.8)：称硼砂(NaB 0 ·HO)4.77g，  用蒸馏水溶解，加0.2mmol/L NaOH 170ml，再用蒸馏水稀释至 1000ml。 ④3mmol/L对硝基酚标准液：取纯化的对硝基酚41.7mg，用蒸馏水溶解并 稀释至 100ml，混匀后置冰箱保存。 (2)荧光光度法：  ①枸橼酸-磷酸盐缓冲液 (pH4.5)：12.6g/L枸橼酸 · HO(60mmol/L)和 13.5g/L无水碳酸氢钠(95mmol/L)各50ml，混合测pH应为4.5。取已配好的上 述缓冲液 (枸橼酸30mmol/L，磷酸盐 47.5mmol/L)50ml，加叠氮钠 10mg，牛血 清白蛋白 50mg，溶解，4℃冰箱可稳定数周，混浊应弃去，此为含牛血清白蛋 白的缓冲液。 ②2mmol/L底物缓冲液：称4-甲基伞形酮-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷 (MW：379.4)7.6mg，溶入10ml含牛血清白蛋白缓冲液中，分装于具塞试管内， －20℃可保存数月，忌反复冻融。 ③酶反应终止液(pH10.4)：称甘氨酸37.5g，溶 1000ml蒸馏水中，加入 920ml 0.5mol/L NaOH，用0.5mol/L NaOH调pH至10.4。 ④300μmol/L 4-MU 标准液：称4-MU 11mg，用终止液溶解并稀释至 250ml，此为贮存液。置棕色瓶4℃保存，至多稳定 10天。 【操作方法】 (1)对硝基酚比色法：按表 1 操作。  -A ) 混合，在 405nm 波长，1cm 光径，蒸馏水调零，读取各管吸光度，用(A 之差查标准曲线。 (2)荧光光度法：先将血清或尿用不含牛血清白蛋白(BSA)的缓冲液作20倍 稀释，按表 2 操作。 混匀，激发波长 364nm，发射波长 448nm，以终止液调零，6μmol/L 4-MU 管调荧光强度至 100后，分别测空白管及测定管的