bsa毛细管电色谱柱的制备和对映体分离 - 中山大学化学与化学工程学院.docVIP

BSA毛细管电色谱柱的制备及对映体分离 伍品端 马志玲* （中山大学化学与化学工程学院，广州，510275） 论文摘要 整体柱是近年发展起来的一种新型的色谱分离分析技术。本组实验以甲基丙烯酸缩水甘油酯和二甲基丙烯酸乙二醇酯为单体和交联剂，以环己醇和正十二醇溶剂和致孔剂，在毛细管内聚合制得整体柱。对整体柱基质用BSA进行修饰，制成手性整体柱后，〔1〕用于组氨酸对映体进行手性分离，并考察了缓冲液pH值对保留时间和分离度的影响。 关键词 整体柱；手性分离；毛细管电色谱；牛血清白蛋白 一 前言 手性药物各对映体的药效学等方面可能存在很大的差异。所以对映体拆分方法具有十分重要的意义。 目前主要利用色谱技术实现对各对映体的拆分，例如气相色谱、高效液相色谱、薄层色谱、超临界流体色谱和毛细管电泳等。〔2〕 毛细管电色谱（CEC）是一种新的微柱分离技术，结合了毛细管区带电泳的高柱效和高效液相色谱高选择性的优点，具有高效、快速、微量等诸多特点，已成为近年来色谱领域研究的热点之一。〔3〕 目前使用的毛细管电色谱柱主要有三类：①填充毛细管电色谱（PCCEC）；②开管毛细管电色谱（OTCEC）；③整体柱（monolithic column）毛细管电色谱。PCCEC制备较困难，并存在焦耳热效应塞子效应气泡效应〔4〕〔〕200608） 第一作者：伍品端，中山大学化学与化学工程学院化学工程与工艺专业（2002级） 指导老师：马志玲 副教授，（联系方式：cesmzl◎sysu..edu.cn） 津市科密欧化学试剂开发中心）； 偶氮二异丁腈（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）；甲醇（分析纯，广州化学试剂厂）；三羟甲基甲胺(Tris，分析纯，FACRO CHEMICAL SUPPLIES);牛血清白蛋白（上海伯奥生物科技有限公司）；D,L-组氨酸（层析纯，中国科学院上海生物化学研究所）；L－组氨酸（层析纯，中国第二军医大学政翔化学试剂研究室）。其余试剂为分析纯。 （二）毛细管壁预处理 依次用1 mol·L-1的NaOH溶液、去离子水、0.1mol·L-1的HCl、去离子水冲洗毛细管内壁30min，再用无水甲醇冲洗10min，最后用N2吹干。 （三）毛细管整体柱的制备 按比例将GMA和EDMA混合为A溶液，将CyOH和DoOH混合为B溶液，再把A溶液和B溶液按比例混合，加入相当于溶液总质量的1％的AIBN。经超声波得到均匀溶液，再向溶液通N2约10min。将溶液注入经预处理的毛细管内，两端密封，用60℃水浴24h。聚合的反应如图Ⅰ所示。 合成整体柱后，依次用甲醇和蒸馏水以0.001mL·min-1流速冲洗整体柱4h。 图Ⅰ 整体柱聚合的反应 （四）手性整体柱的制备 配制pH 7.4，67mmol·L-1生理磷酸盐缓冲液。称取适量BSA溶于生理磷酸盐缓冲液中，配成4mg·mL-1的BSA溶液。又配制pH 8.0，50mmol·L-1的Tris-HCl缓冲溶液。 将以上制得的毛细管柱用生理磷酸盐缓冲液冲洗约1h，再将4mg·mL－1的BSA溶液通过毛细管柱24h。再用生理磷酸盐缓冲液冲洗柱子约1h，然后分别用纯净水和pH=8.0的50mmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液冲洗2h，最后用磷酸盐缓冲溶液冲洗4h。 （五）整体柱的观察 在小试管中合成整体柱后，将小试管打破，取出整体柱并压碎，用甲醇萃取12h。然后烘干1d，准备用氮吸附法和场发射扫描电镜观察整体柱的孔径分布。 （六）毛细管电色谱实验 1 配制2mmol·L-1的pH为5.0、5.5和6.0的磷酸盐缓冲溶液 2 配制样品溶液 用以上所配的的磷酸盐缓冲溶液（pH＝5.0、5.5和6.0）作溶剂，分别溶解适量的D，L-组氨酸和L-组氨酸样品，配成约50mg·L－1的样品溶液。 取相同体积50mg·L-1的D,L-组氨酸(用pH5.5缓冲溶液配制)和L-组氨酸溶液(用pH5.5缓冲溶液配制)混合，配成50mg·L-1的D,L组氨酸＋L-组氨酸溶液。 3 电泳实验 各种用于CEC的缓冲溶液、样品溶液在使用前经0.45μｍ滤膜滤过并超声脱气。在手性毛细管柱的一端施加一定的正电压，使用pH=5.5的2mmol·L－1磷酸盐缓冲溶液通过手性毛细管柱，在此期间通过控制电压使电流不超过5uA。约过30min左右使基线平稳。 分别重力进样用pH5.5缓冲溶液配制的浓度为50mg·L-1的D,L-组氨酸和8s。在＋6.0kV的分离电压下，以pH=5.5的2mmol·L－1磷酸盐缓冲溶液作运行液，采集电导信号20min。 重力进样用pH6.0缓冲溶液配制的浓度为50mg·L-1的D,L-组氨酸8s。在＋6.0kV的分离电压下，以pH=6.0的2mmol·L－1磷酸盐缓冲溶液作运行液，采集电导信号。 重力