噬菌体效价的测定.pptVIP

四、实验步骤 1、制备底层平板 将已灭菌融化的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板9个（倒薄一些），凝固。 2、加入大肠杆菌敏感菌 在每个牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，无菌条件下，各皿加入敏感菌菌悬液0.9mL。 3、稀释噬菌体 取1mL含噬菌体液加入到 9mL牛肉膏蛋白胨培养液中，采用10倍稀释法，分别制备噬菌体稀释液（10-5、 10-6 、 10-7 ）。 4、噬菌体与大肠杆菌敏感菌混合 将已加有大肠杆菌敏感菌9皿平板（ 10-5 、 10-6 、 10-7各3皿）中，分别加入0.1mL噬菌体稀释液，混合后放置5分钟。 5、加入上层培养基 将5mL溶化的半固体培养基中迅速倒入含噬菌体与大肠杆菌敏感菌平板中（45~50℃），并混合均匀。静止凝固。 6、培养 37℃培养2.5小时或室温培养12小时。 7、观察、计数 观察平板中的噬菌斑，将每一稀释度的噬菌斑形成单位（pfu）记录于表格内。 8、计算噬菌体的效价 选取30~300个pfu数的平板计算每毫升未稀释的原液的噬菌体效价。 噬菌体效价（pfu/ml）= 噬菌斑数×10× 稀释倍数 实验步骤框图（教师进行演示操作） 用牛肉膏蛋白胨固体培养基倒平板9皿（薄一点） 噬菌体稀释液（10-5、10-6、10-7）0.1mL 敏感菌菌悬液0.9mL 放入已有底层固体培养基的平板中 混匀放置5分钟 将5mL溶化的半固体培养基中倒入上述平板中（45~50℃） 混匀（动作？） 37℃培养5小时或室温培养12小时 观察结果计数 教科书介绍方法的操作步骤 噬菌体稀释液0.1ml 大肠杆菌培养液0.9ml 45~48℃溶化好牛肉膏蛋白胨半固体培养基4ml 混匀吸附5min 搓动混匀后倒于有底层的平板中 铺平 37 ℃培养5~6小时，观察计数 思考题 噬菌体稀释度 10-5 10-6 10-7 1 2 3 平均 1 2 3 平均 1 2 3 平均 pfu数/平板 每毫升中的pfu数 1、记录结果，并进行统计分析。 2、什么因素决定噬菌斑的大小？ 3、如果在你的测定平板上，偶尔出现其他细菌的菌落，是否影响你的噬菌体效价测定？ 4、噬菌体效价测定实验中所用操作方法和书上介绍的操作方法比较有什么优缺点？ 下周实验内容 微生物（细菌）的常见生理生化反应 要点： 1、掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。 2、了解糖发酵的原理和在细菌鉴定中的重要作用。 3、掌握通过糖发酵（葡萄糖、蔗糖、乳糖）鉴别不同微生物的方法。 4、了解IMViC（吲哚、甲基红、伏-普、柠檬酸）与硫化氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。 实 验 九 噬菌体效价的测定 目的要求 1、掌握噬菌体效价测定的原理及方法 2、观察噬菌斑的形态 实 验 内 容 一培养基和实验物品的准备 本次实验准备工作（2人/组） 1、配制牛肉膏蛋白胨液体培养液（ pH 7.4-7.6 ）； （已准备好）。 2、测定效价时稀释用9ml牛肉膏蛋白胨液体培养液—— 2支/组，分装于18×180mm试管； 3、牛肉膏蛋白胨固体培养基（2%的琼脂）——底层用，150ml/组，装于250ml三角瓶， （用于制备9个无菌平板，倒薄一点） 4、上层用5ml牛肉膏蛋白胨半固体培养基（0.8 %的琼脂），融化后分装于15×150mm试管中加塞包扎灭菌，10支/组；（上周已准备好）。 5、1ml无菌吸管 4支/组。 实 验 内 容 二噬菌体知识介绍 一、几个重要概念 1、噬菌体： 是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒，分布极广，个体很小，在光学显微镜下看不见，需用电镜观察。 不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌蚪形、微球形和丝形。大多数噬菌体呈蝌蚪形，由头部和尾部两部分组成。 2、噬菌斑： 在混浊的细菌菌面（菌苔）上形成的透明区域，是由噬菌体不断侵染宿主细胞裂解形成的，其形状、大小不等。 3、噬菌体效价： 指1mL样品中所含具有侵染活性的噬菌体（烈性噬菌体）数量——噬菌斑形成单位（pfu，plaque-forming unit）。 效价（titre，titer）这一名词在不同的场合有其不同的含义（如抗生素等）。 二、病毒粒子的构造（模型） 噬菌体的形态及分类科属 大肠杆菌T4噬菌体结构示意图 大肠杆菌T4噬菌体结构示意图及电镜照片 头部 六角形基板 领环 螺旋形尾鞘 核心或管（中空） 尾刺或刺突 尾丝 噬菌斑示意照片 宿主细菌菌苔 噬菌斑 大肠杆菌T噬菌斑的表型形态 三、噬菌体的分类——根据噬菌体与宿主菌的相互关系 烈性噬菌体（virulen