原核表达步骤总结.docVIP

原核表达步骤 原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入JM109菌株中。 鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达 制样 1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于00ul LB培养基，加入0.ul Amp（100mg/mL），37oC200r/min摇床培养，过夜活化。 以1：50比例（200u），将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中，加入10uLAmp（100mg/m），37oC200r/min摇床扩大培养3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD在0.6-1.0之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态 3. 从10m扩大培养物中取3m菌液为不加IPTG的空白对照（CK），其余7菌液加入7IPTG（mol/l），使IPTG终浓度达到mmol/l。以200r/min的转速，37oC摇床培养3h。 以000r/min离心min收集菌体，倾倒上清，每个离心管收集3m培养物。 加入dH2O，将管底沉淀散以充分洗涤，8000r/min离心2min，倾倒上清。 重复步骤5。 （二）菌落SDS 1. 在中加入SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀