第九章 园艺植物遗传转化载体的构建.ppt

一个理想的载体应该具备以下几个特点： 有一个或多个复制起点，可在一种生物体中自主复制 至少有一个多克隆位点，以供外源DNA插入 至少有一个遗传标记基因，以指示重组DNA分子是否进入宿主细胞 具有较小的分子质量和较高的拷贝数 无毒性 基因工程中所用载体的分类 按来源分类 细菌质粒 噬菌体类 酵母质粒 病毒DNA衍生物 基因工程中所用载体的分类 在植物基因转化的研究中，主要使用细菌质粒，按用途可分为： 克隆载体 表达载体 转化载体 按功能及构建过程分类 构建表达载体流程？？？ 基因：CBF（抗寒基因） 载体：PMD-Simple18, PET-32a 材料：白菜叶片 请写出构建表达载体的流程，并注释每步的注意事项及关键点？ 3、冠瘿碱（opine）合成酶基因 冠瘿碱合成酶基因（nos和ocs）存在于农杆菌T-DNA上，因其启动子是真核型，在 农杆菌中不表达，故通过检测转化体中冠瘿碱的存在就可确定外源基因的表达。冠瘿碱 的检测分析简单、快速和廉价，但受伤植物有时也会产生冠瘿碱，故必须设置对照。 4、花青素合成有关的基因 　 利用与花青素合成的有关基因作为报告基因，可使转化体呈现特有颜色，那 么就可以用肉眼鉴别。 例如，利用玉米种子编码调控花青素生物合成的反式因子的调控基因C1、B 和R，导入这些基因后可以在非种子组织诱导产生色素。 红色荧光蛋白标记导入小肠绒毛细胞中，展现出带有荧光 转红色荧光蛋白唐鱼与对照鱼 5、其它报告基因 第四节 园艺植物常用的遗传转化载体类型 根据目的基因插入的方向和转化目的的不同,将园艺植物遗传转化载体分为正义表达载体、反义表达载体、RNA干涉载体和基因打靶载体。 第五节 目的基因与载体的连接 目的基因与载体的连接方法主要有插入灭活法和定向克隆法。 一、插入灭活法 第五节 目的基因与载体的连接 二、定向克隆法 定义： 将目的基因按正确方向插入载体的方法。 平末端DNA片段连接主要有3种方法： 同聚物加尾法 衔接物连接法 DNA接头连接法 * /Education/LessonsPlantPath/CrownGall/pathbio.htm /Education/LessonsPlantPath/CrownGall/symptom.htm * 第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建 1.基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略 (3) 共整合载体的选择 通过pGV3850和pGV1103质粒同源重组形成的共整合载体能够不断复制和增殖,整合在Ti质粒中的中间载体随同Ti质粒得岂到复制和增值.中间载体所带有的抗性基因(Ampr,Kanr,Smr或strr)都能得到表达.此时含有共整合质粒的农杆菌将表现出中间载体携带的抗性标记,从而在含有相应抗生素的培养基上得到生长和筛选.未发生重组的pGV3850,pGV1103等均不能生长.含有共整合质粒的根癌农杆菌即可用于植物的转化. 第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建 1.基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略 (3) 共整合载体的选择 整合后的Ti质粒含有重复的pBR322序列,此重复序列在农杆菌转化植物细胞的过程中,与目的基因及选择标记基因一起被整合到植物染色体组上.但这种重复的序列有可造成基因的进一步重组及重排,从而影响外源基因的表达.因此,在对pGV3850系统进行改进的基础上,获得了pGV2260载体系统. 第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建 1.基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略 (3) 共整合载体的选择 pGV2260系统: 来自章鱼碱型Ti质粒的pTiB6S3,整个T-DNA序列连同25bp末端序列均被一段pBR322所取代。与pGV3850的区别在于pGV2260系统的中间载体必须在外源基因两侧连接25bp末端序列.共整合发生后,pGV2260系统中的pBR322重复序列在25bp末端序列以外,不会随T-DNA一起整合到植物染色体中. 第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建 2.SEV系统的构建 1985年美国孟山都公司的Fraley等建立了另一种共整合载体,即拼接末端载体(split-end vector,SEV)系统即T-DNA边界拼接系统,也因为它的两个“左边界内部同源区”(left inside homology,LIH)序列在同源重组前分别处于不同质粒上而得名. 第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建 2.SEV系统的构建 构建过程: (1) SEV的受体Ti质粒是pTiB6S3-SE,来自野生型质粒pTiB6S3的突变体. 它的TL-DNA上的致瘤基因(onc)及TR都缺失,T-DNA的保留部分被称为LIH,即左边界内