4.3特殊变异菌筛选方法.pptVIP

* 4.3 特殊变异菌的筛选方法： 以温度敏感突变为例： 筛选方法： 用途：常用于提高代谢物产量 原因：是由于某一酶蛋白结构改变后，在高温下活力丧失 重要性：如果此酶为蛋白质、核酸合成途径中所需的酶，则此变异株在高温下的表型就是营养缺陷型。 4.3.1条件抗性突变型的筛选 举例： 由谷氨酸产生菌乳糖发酵短杆菌2256，经诱变处理得到温度敏感变异株Ts88: 30℃培养时能正常生长 40℃是死亡，但能在富含生物素的培养基中积累谷氨酸（而野生型却受生物素的反馈抑制）。 在富含生物素的培养基中进行发酵时： 先在30℃（允许条件）中进行培养以得到大量菌细胞，适当时间后提高温度（ 40℃ ，非允许条件），即能获得谷氨酸的过量生产。 方法：梯度平板法（gradient plate） 4.3.2抗药性突变株的筛选 抗药性突变株的应用： 作为菌株的遗传标记 作为生产菌种（结构类似物抗性变异株） 4.3.3抗生素抗性变异株的筛选： ★与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体： 营养缺陷型：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。如：lys -， bio- 野生型：自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。 如：lys + ; bio + ; 原养型 ：指营养缺陷型突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。 4.3.4 营养缺陷型(auxotroph)的筛选 ★与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基 基本培养基（MM）[-]：凡是能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。 完全培养基（CM）[+]：满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。 补充培养基（SM）[x]：在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。 ★营养缺陷型诱变筛选步骤及方法 auxo的鉴定 诱变处理 auxo的浓缩 auxo的检出 缺陷型的浓缩： ①抗生素法 原理： 青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞，对休止态细胞无作用。 方法：将菌培养在含抗生素的MM基中 ②菌丝过滤法 适用于：丝状（放线菌、霉菌） 原理：基本培养基上只有发育成菌丝；auxo孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。 ①逐个检出法： 缺陷型的检出： ②影印平板培养法 ③夹层培养法 ①生长谱法 方法简便； 回变和污染不影响 结果 测定物质可为粉末 或纸片 缺陷型的鉴定： 测定一般应分两阶段： 第一阶段：测定是哪类物质的缺陷型； 第二节段：根据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具体化合物的缺陷型； 组合营养物法： 步骤（以氨基酸缺陷型的鉴定为例）： a. 将多种营养因子编组； b. 将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养； c. 结果分析； 如： 一组：1 2 3 4 5  二组：2 6 7 8 9 三组：3 7 10 11 12 四组：4 8 11 13 14 五组：5 9 12 14 15 营养因子分组编排时注意； 1）每组内无重复的营 养因子 2）每组中应包含只出 现一次的因子 3）每组中其他因子应 分别出现二次 * * * 野生型：从自然界分离到的任何微生物在其发生营养缺陷突变前的原始菌株。 营养缺陷型：野生型菌株经诱变处理后，丧失了某酶的合成能力，只能在加有该酶合成产物的培养基中生长，这类突变称为营养缺陷型突变株（简称营养缺陷型）。 原养型：营养缺陷型突变经回变或重组后产生的菌株，营养要求在表型上与野生型相同。 即淘汰野生型 例：青霉素法，适合于细菌。 青霉素能抑制细菌细胞壁的合成，能杀死生长着的细菌，对休止态细胞无作用。