肝糖原的提取鉴定与定量-实验报告-第四实验室.doc

生物化学实验报告 姓 名： 学 号： 专业年级： 2015级护理本科 组 别： 第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 实验日期 实验地点 第实验室 合作者 指导老师 评分 教师签名 批改日期 实验目的实验原理 采用研磨匀浆使细胞破碎，用低浓度的三氯醋酸使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶从而使其沉淀，而糖原仍稳定保持在上清液中，从而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故用95%乙醇溶液将糖原沉淀，再用热水溶解。 2.糖原的鉴定 (1)糖原螺旋链吸附碘分子： 糖原水溶液呈乳样光泽，其长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子，呈现出红棕色。 (2)呈色反应——利用葡萄糖的还原性： (CuSO4+2NaOH = NaSO4 + Cu(OH)2↓ (2Cu(OH)2 + C6H12O6 = 2CuOH + 氧化型葡萄糖+ H2O (2CuOH = Cu2O↓(红色) + H2O ④Cu(OH)2 = C u O ↓（黑色）+ H2O 1.糠醛衍生物的生成及其性质 糖原的水解产物葡萄糖可以在浓硫酸的作用下生成糠醛衍生物-5-羟甲基呋喃甲醛，其可以和蒽酮生成蓝色的化合物，该物质在620nm处有最大吸收。 2.标准对照法进行定量 糖含量在10μg～100μg，溶液颜色的深浅与可溶性糖的含量成正比，利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。 材料与方法肝糖原的提取与鉴定实验材料：样品：鸡肝 （2）试剂：5%三氯乙酸溶液、95％乙醇溶液、蒸馏水、浓盐酸、50%氢氧 （3）仪器和器材：剪刀、天平、镊子、圆纸片、研钵、试管、离心机、刻 实验流程 鸡肝约1.5 g，剪碎 ＋5%CCl3COOH 1 ml 研磨至乳状 ＋5%CCl3COOH 3 ml 研磨成肝匀浆 全部转入离心管中，离心3分钟（4000 r / min） 沉淀（弃去） 上清（取3 ml） ＋3ml 95%乙醇，混匀，静置10分钟 离心5分钟（4000 r / min） 上清（弃去） 沉淀 ＋蒸镏水1 ml 沸水浴2分钟，溶解沉淀 白瓷板孔穴中 糖原溶液1ml ＋浓HCl 5滴 加碘试剂2滴 加碘试剂2滴 沸水浴15分钟，冷却 糖原溶液2滴 ＋50%NaOH 5滴 呈色对比 糖原水解液2滴 糖原水解液 ＋班氏试剂4滴 混匀 沸水浴2分钟，观察变化 操作 （1）肝匀浆准备 称取肝组织约1.5g，放入盛有1ml5%三氯醋酸的研钵中，将肝组织磨至乳状后，再加入5%三氯醋酸3ml，在磨成肝匀浆，4000r/min离心3min，上清液倾入另一干净离心管中。 （2）提取糖原 向上清液中加入等量的95%乙醇，混匀，静置10min，离心5min（4000 r/min）。倾去上清液，白色沉淀为糖原。加入蒸馏水1ml，并加热使沉淀溶解，溶液呈乳样光泽。 （3）糖原鉴定 与碘反应：取碘试剂2滴于白瓷板孔穴中，加糖原溶液2滴，观察其呈色。另一孔穴只加碘试剂2滴，作呈色对比。 糖原水解液汇总葡萄糖的鉴定：取糖原溶液1ml于小试管汇总，加浓盐酸5滴，置沸水浴中水解15min，取出冷却。用50%NaOH中和（约5滴）。另取一小试管加班氏试剂4滴，加上述糖原水解液2滴混匀，在沸水浴中（或直接在酒精灯上）加热2min，观察并记录所见 （二）肝糖原定量测定 1.实验材料：样品：鸡肝 （3）仪器和器材：剪刀、天平、镊子、圆纸片、试管、刻度吸量管（移液 2.实验流程 鸡肝0.15 g ＋30%KOH 1.5ml （用吸量管） 沸水浴15分钟