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第四章 Vector.ppt

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第四章 Vector

■pYAC3的结构 pYAC3是在pBR322基础上插入酵母基因构建而成的。如URA3和TRP1等。 携带TRP1(色氨酸合成酶基因1)的同时也包含一个复制起点(ori)。 CEN4(酵母基因组的着丝点序列) 端粒,由酵母中两段称为TEL的序列提供。 SUP4,作为插入片段的选择标记基因。SUP4基因编码赭色抑制tRNATYR,抑制赭色表型(成为白色)。如果用不含外源DNA片段的YAC3载体转化酵母菌,转化子的菌落呈白色;而带有插入的外源DNA片段的YAC3重组载体,其SUP4已经失活,结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。 URA3,尿嘧啶核苷酸合成酶基因3 ■pYAC3的应用 载体首先被BamHI和SnaBI酶切将分子切成三块,BamHI片段被去掉,剩下两个臂都以TEL作为末端,另一端是SnaBI位点。 待克隆的DNA被连接在两个臂的中间就产生了人工染色体(注意:待克隆的DNA必须是平末端,因为SnaBI是一个平端酶,识别序列是TACGTA)。 利用原生质转化法将人工染色体引入酵母。受体酵母是一个双营养缺陷体trp1-ura3。 转化后于基本培养基上培养。插入片段的鉴定可以通过SUP4基因的插入失活,红色的克隆是重组子,白色的不是。 4. 人工染色体载体的发展 1987年 Burke等构建了能克隆200kb大片段人体DNA分子的YAC(Yeast Artificial Chromosome),比载体容量大10倍。 1992年 Shizuya等构建了能克隆300kb大片段的细菌人工染色体BAC(Bacteria Artificial Chromosome),可高效转化。 1994年 Ioannou等发展了基于原噬菌体P1的人工染色体PAC,能容纳100kb~300kb,容易转化。 1997年 Harrington等报道合成了人类人工染色体HAC(Human Artificial Chromosome),长度6Mb~10Mb,相当于正常染色体的10~15分之一。 5. 人工染色体载体的应用 ■构建基因组文库 人工染色体载体最大的特点是可容纳比其它克隆载体大得多的外源DNA片段,因此被首先用于构建人类及其它高等动物的基因组文库,减少了克隆子的数目。如:构建了人类、玉米、大麦、番茄、水稻的YAC文库。 ■基因治疗 MAC及HAC巨大的外源DNA片段能容纳完整的基因家族,从而有可能校正多个突变位点引起的致病突变,并且MAC及HAC不会像病毒克隆载体那样产生细胞毒害、免疫原等负面效应。此外,还可根据需要构建不同的人工染色体。 ■基因功能鉴定 由于人工染色体载体巨大的承载外源DNA的能力,不仅能容纳基因的编码序列,而且能容纳基因的内含子、调控序列,此外,它能像正常染色体一样与各种细胞因子进行相互作用,其基因表达及调控机制和正常染色体一样,因此可用它去进行基因功能鉴定。 Fig. 4-60 Eukaryotic chromosome structure Trp1 色氨酸合成酶基因1 URA3 尿嘧啶核苷酸合成酶基因 3 SUP4基因编码赭色抑制tRNATYR Fig. 4-61 The structure and application of pYAC3 vector Lesson 4 Specific Vector 1. 启动子探针型载体 ■启动子及启动子探针型载体 启动子:是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。 启动子探针型载体:是一种有效、经济、快速分离基因启动子的工具。 ■启动子探针型载体必备的两个条件 转化系统 检测部件:(1)一个已失去转录功能且易于检测的遗传标 记基因;(2)克隆位点(一般位于遗传标记基因的上游,供待检测的启动子插入)。 ■启动子探针型载体构建的基本策略 将待检测的启动子插入失去转录功能的遗传标记基因上游的克隆位点中,检测遗传标记基因的转录功能是否恢复,从而判断待检测启动子是否为真实启动子。 ■用于制备启动子探针型载体常用的选择标记基因 Kanr基因(卡那霉素抗性基因):基因的表达产物可使受体细胞能在含有卡那霉素的培养基上生长。 GFP基因(绿色荧光蛋白基因):基因的表达产物是一种在一定波长光波激发下发出绿色萤光的蛋白。 Hphr基因(潮霉素抗性基因):基因的表达产物可使受体细胞能在含有潮霉素的培养基上生长。 以Kanr基因作为选择标记基因的pSUPV4启动子探针型克隆载体。将待检测的DNA序列插入多克隆位点中(MCS),随后转染受体细胞,如果受体细胞能在含Kan培养基中生长,表明待检测的DNA序列是启动子,否则,不是启动子。 Fig. 4-62 启动子探针型载体 2. 诱导表达型载体 ■诱导表达型载体 启动子必须在特殊的诱导条件下才有转录活性或比较高的

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