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western blot转移电泳一般操作流程? ?? ? 总的来说，半干转、湿转的程序和基本原理是相同的。胶和膜预稀释并用电转缓冲液平衡；滤纸/胶/膜/滤纸三明治放入电转设备中；正确的方向确保蛋白转移到膜上。合适的电压/电流条件对于电转的成败是非常重要的。 电转缓冲液和电转条件的选择 对于不同的电转设备，当选用不同的胶和缓冲液时，要求不同的电压/电流。变性凝胶需要增加电转时间，而低分子量的蛋白需要相应的缩短电转时间。现在实验室常用的Bio-rad小型 Mini Trans-Blot转印槽（湿转）和Trans-Blot半干转印系统转印槽（半干转）相应的电转参数如下表： ? ???  槽式转印 半干转印 Mini Trans-Blot槽 Trans-Blot半干转印系统转印槽 印迹区域（宽 x 长） 10 x 7.5 厘米 24 x 16 厘米 转移参数 凝胶夹数 2 - 缓冲液要求 450ml ≤200 ml 电极距离 4cm 按夹层结构厚度确定 转移时间（高强度） 60分钟 15–60 分钟 冷却 蓝胶冷却装置/冷却旋管 - 凝胶容量 18.3 x 19.3 厘米 - 1 块凝胶（2 块凝胶堆叠） 16 x 20 厘米 - 1 块凝胶（2块凝胶堆叠） 16 x 16 厘米 - 13.3 x 8.7 厘米 - 3 个凝胶并列 8.3 x 7.3 厘米 每个凝胶夹1块凝胶共2个凝胶夹（两种尺寸） 4个凝胶并列 8.6 x 6.8 厘米  通常我们在做湿转的时候，选择100V恒压（高强度，因为低强度时间较长，且效率较低），电流控制在120-350mA之间，分子量在60KD以下的60分钟即可，分子量在60KD以上的需要延长转膜时间60-150分钟才能确保高效率的转膜。所以如果你所需要转印的蛋白分子量差得比较多（如GAPDH 37KD，Ki67 358KD），你可以考虑将胶从中间分开，两部分分别采用不同时间转印，能达到你理想的效果。电转液一般可以重复使用3次，之后电流会过大，不适合再使用。 ? ?? ? 而对于半干转，我们一般选择恒流（膜面积的3倍：3 mA/cm2） 之间一般60分钟，同样根据蛋白分子量适当调节时间。 ? ??? 需要注意的是：低温对于膜的转印是至关重要的，尤其是在转印时间较长而无人监管的情况下。经过转印的胶和膜都要通过染色确定转膜效率（胶用考马斯亮蓝加热染色，膜用丽春红染色，均只需几分钟，并不耽误太多时间），不然后面的实验既费时也费抗体。 具体的对于电压/电流的选择，可以参照下表。但合适的电转条件需要根据凝胶的厚度、膜的种类、蛋白分子量、电转缓冲液选择最优化的方案。 SDSGels (Towbin Buffer) 低强度 高强度 Mini Trans-Blot槽? 30 V/90 mA, 16 hr 100 V/350 mA, 60 min Trans-Blot半干转印系统转印槽 N/A Mini gels: 10–15 V/5.5 mA/cm2, 10–30 min Large gels: 15–25 V/3 mA/cm2, 30–60 min Isoelectric??Focusing Gels, Native Gels, Basic Proteins, and Acid-Urea Gels (0.7% acetic??acid) 低强度 高强度 Mini Trans-Blot槽? 30 V/10 mA, 16 hr 100 V/350 mA, 1 hr Trans-Blot半干转印系统转印槽 N/A Mini gels: 10–15 V/5.5 mA/cm2, 10–30 min Large gels: 15–25 V/3 mA/cm2, 30–60 min