具有抑制VCAM-1基因表达活性的化合物Zelkovamycine的研究.pdfVIP

中文摘要 具有抑制VCAM-I基因表达活性的化合物 zeIkovamyciRe的研究 摘 要 ／炎症为临床上的一种高发性疾病。人体内许多炎症反 应白：卜个共同表现是炎症性细胞的集簇浸润。由于受人体 内炎症部位释放出的TNF-a、IL-lp等炎症性细胞因子的 刺激，血管内皮细胞分泌出多种细胞粘着因子，白细胞在 这些粘着分子的作用下粘附于血管内皮细胞上并进行滚 动，继而引发白细胞对血管内皮细胞浸润的发生。 近年来的研究结果表明，由细胞粘着分子介导的白细 胞的粘着为炎症反应能够得以进行的一个不可欠缺的过 程。目前已知有两种细胞粘着分子在这一过程起着非常重 adhesion 要的作用。它们是ICAM(Intercellular molecule)和 celladhesion VCAM一1(Vascular molecule)。其中，VcAM一1为分子量110KD的蛋白质分子。 受外源性信号激活的转录因子NF-KB控制着VCAM—l 基因的表达。当炎症性细胞因子TNF一仪或IL-IB与位于血 管内皮细胞膜上的受体作用后，引发细胞内一系目前尚不 完全清楚的反应过程，使无活性的NF-KB的前体变成活性 型的NF—KB分子(由p56和p50蛋白亚基组成的异源性二 聚体)，随后NF—KB经核孔移至细胞核中，与染色体DNA 分子中位于VCAM一1基因上游的一段称为NF一1cB结合区域 T (碱基序列为GGGACTTCC)的位点相结合，启动vcAM一1 中文摘要 基因的表达。 可以设想，通过抑制VCAM一1分子的表达可以阻止由细 胞粘着分子VCAM-1介导的白细胞的粘着这一过程的发生， 从而控制炎症反应的进行。上 我们以控制VCAM-I表达的NF—KB及其结合序列为靶位 点，将含有NF—KB结合序列的VCA～I一1基因上游非转录区 的2Kb DNA片断与萤光素酶(1uciferase)基因相连接， 构建成重组细胞IL一14，利用IL一14细胞筛选微生物来源 的能够抑制VCAM一1表达的活性物质。f由活性化合物造成 的NF—KB与其结合位点功能的改变将影响到位于其下游 的萤光素酶基因的表达。因此，用添加样品前后细胞内萤 光素酶活性的下降可以间接检出对由TNF—a诱导的 VCAM一1的表达有抑制作用的化合物，可望由此找到新的治 疗炎症性疾病的药物。 1．研究旧的： 使用上述筛选模型，从多株放线菌的发酵液中分离得 到了一个对IL—14细胞的与VCAM—l基因的启动子(NF～KB 的结合序列部分)相连接的荧光素酶基因的表达有较强抑 制作用的化合物。 屈．方法： ＼ IL—14细胞来源于人脐带内皮细胞系ECV304，为贴壁 的培养基中于37C、5％C02的条件下每天分裂一次。取 培养好的IL—14细胞用上述培养基配制成为1．5x105个 ／ml的细胞悬液，用八联移液器按200pl／孔将细胞悬液 注入到96孔板上，使每孔中有3×104个细胞。37。C、 中文摘要 5％C02条件下培养5小时，按5“1／孔加入待测样品，对 照孔不加样品。于37。C、5％C0：培养箱中培养1小时，各 孔中分别加入浓度为440ng／ml的人TNF一伐或浓度为 220ng／ml的人IL一1B lOpl，使每孔中TNF—if,或IL一1p的 中培养19小时。 弃去上层培养液，每孔中加入萤光素酶测活缓冲液 (30mmol／L EDTA ATP：0．5mmol／LCoA： 0．2mmol／L 1．5mmol／L 0．5mmol／Lluciferin：0．1％TritionX-100：lOOmmol／L count(Pa