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花粉管通道法导入黑籽南瓜DNA创造黄瓜新种质 园林园艺学院 张应华 研究意义 黄瓜病害 大片段导入法 近年来可转化载体BIBAC2、TAC等已被用于番茄、矮牵牛、拟南芥、水稻、油菜、大豆、甜菜、香蕉等物种基因组文库或亚库的构建。 而且在拟南芥（Tsujimoto et al., 2003），水稻和马铃薯（Kubo et al., 2005）中已经实现了大片段DNA的转移。 Hamilton等通过农杆菌介导的方法将克隆在BIBAC2中的完整的150Kb的人类DNA片段转化进了烟草和番茄，而且能在受体基因组中稳定，多代没有发现基因沉默[14]。 Liu等（2000）利用TAC载体已分别将80Kb的插入片段转到了拟南芥和水稻中，Qu 等（2003）用TAC将45Kb的片段转入水稻中。 因此，大片段基因组可转化载体文库在未来研究中有很好的前景。 研究目标 ①构建第一个高质量的云南黑籽南瓜基因组大片段可转化细菌人工染色体文库。 ②从文库中筛选获得带黑籽南瓜抗病基因同源片段（STK类、NBS-LRR类）的阳性侯选克隆一批。获得20个转化用阳性克隆。 ③获得有黑籽南瓜大片段基因组DNA的黄瓜20个“插入系”，它们携带的黑籽南瓜基因组DNA累计达到1.6Mb(20 X 80kb=1.6Mb)。 ④获得一批具有部分黑籽南瓜遗传性状，部分抗病能力显著提高的黄瓜“插入系”，这些“插入系”是黄瓜育种的直接或中间材料，也是研究黑籽南瓜基因及其功能的工具材料。 ⑤培养研究生数名、发表高档次学术论文3篇 一、技术路线 创新点 云南的黑籽南瓜遗传资源非常丰富，具有许多优良遗传特性，目前还没有关于其基因组大片段可转化载体文库的构建及转化应用的报道。 本项目的创新之处，第一，首次用新型可转化细菌人工染色体为载体构建云南黑籽南瓜基因组大片段文库。 第二，探索性地用植物抗病基因的保守结构域设计的简并引物快速简便地筛选文库中黑籽南瓜的抗病基因同源片段的大片段克隆用于转化，在大片段文库的筛选上建立一种新方法。 第三，摸索利用黑籽南瓜染色体大片段转化到黄瓜中获得稳定的“插入系”，为今后全面采用此方法有效快速地使黑籽南瓜全基因组以许多大片段分别进入黄瓜后形成一整套“插入系”而建立新方法。该套“插入系”将是研究解析黑籽南瓜功能基因组的工具材料，其中部分“插入系”还将是黄瓜育种的直接或中间材料。 * * 利用黑籽南瓜有抗瓜类枯萎病的特性，用作砧木嫁接黄瓜、西瓜、甜瓜等作物，嫁接后的黄瓜，生长势旺，根系发达，耐旱耐寒，抗逆力强，高抗黄瓜枯萎病，使黄瓜增产增收，在北方高效节能日光温室中栽培，曾创亩产值2万元的纪录 BIBAC载体 药用野生稻基因组DNA 提取Plug制备 质粒的提取纯化、酶切线性 部分酶切消化，脉冲电脉选择片段化、去磷酸化（60－100kb) 连接、转化、克隆, -700保存文库 参照已报道植物抗病基因保守序列,设计合成简并引物 PCR法筛选克隆20个带抗病同源序列的BIBAC克隆 回收PCR产物 提取质粒，花粉管通道法导入黄瓜 测序,设计合成特异引物 PCR检测 获得插入系 表型和抗病鉴定 分析抗病基因进入栽培稻的类型和数量 黄瓜创新性材料 收获黄瓜种子，发芽，种植 * * *