细菌的基因转移与重组.pptVIP

基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering 第 一 节DNA的重组 DNA Recombination ①两个同源染色体DNA排列整齐 ②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体 ③通过分支移动产生异源双链DNA ④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA. Holliday intermediate的电镜照片 第 二 节 重组DNA技术 （二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 cDNA (complementary DNA) 基因组DNA (genomic DNA) 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 （一）目的基因的获取 1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 三、重组技术与医学的关系 利用乳腺生产药用蛋白的转基因羊 把白蛋白基因转入着乳腺中，这样，转入的白蛋白基因在羊乳腺中表达。通过其分泌不断产生白蛋白。通过分离、纯化，可以得到药用白蛋白，解决临床上病人对白蛋白的需求。 转入标记基因的转基因猴 用于人体器官移植的转基因猪 转基因抗冻西红柿transgenic anti-chilling tomatoes 延熟保鲜的转基因番茄转基因（transgenic anti-ageing tomatoes） 思考题 何为同源重组,其特点是什么?holliday中间体是什么? 什么是接合作用(conjugation)、转化作用（transformation）、转导（transduction） 何为转座? 常见的两种转座子是什么?组成上有什么特点？ 什么是基因工程(genetic engineering),基因工程包括哪些基因步骤？ 基因工程的手术刀-限制性核酸内切酶在识别序列和切割上有什么特点？ 目的基因获得的方法有哪些？ 作为基因工程的载体应具有哪些特点? Golden rice vitamin A = retinol - produced by animals in liver, milk and eggs plants do not produce vitA - but some produce ?-carotene, a precursor for vitA including “yellow vegetables”, yellow endosperm corn and sorghum in many developing countries, vitA deficiency is a major problem: （五）重组体的筛选 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等 (插入失活法) 抗药性标记选择 目 录 组氨酸缺陷 型大肠杆菌 无组氨酸 的培养基 酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因 促进组氨酸合成 λDNA 重组体 标志补救 目 录 α互补 目 录 α 互补的检测 目 录 原位杂交 目 录 Southern印迹 目 录 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出 目 录 重组DNA技术操作过程可归纳为 小 结 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 目 录 表达体系的建立 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化 （六）克隆基因的表达 1. 原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用） 标准：选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足 不宜表达真核基因组DNA 不能加工表达的真核蛋白质 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶