抗抗体体的的制制备备方方法法与与原原理.pdf

生物秀实验频道——生命科学实验中心 ！  /bio101/  抗体的制备方法与原理 抗 体 的 制 备 方 法 与 原 理 一、抗血清的制备 有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好 （特异性强和效 价高）的抗体。 （一）用于免疫的动物 作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实 验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要 获得抗血清数量，如一般制备抗 r­免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良 好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最 好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中 死亡的影响。若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以 2～3kg为宜。 （二）免疫途径 免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等， 一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射 0.1ml左右。途径的选择决定于抗原的生 物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。 （三）佐剂 由于不同个体对同一抗原的反应性不同， 而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强 有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较 强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。 佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺 激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进 T细胞与 B 细胞的相互 作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。 常用的佐剂是福氏佐剂（Freund  adjuvant）,其成分通常是羊毛脂 1份、石腊油 5  份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为 1：2～9 （V/V），这是不完全福氏佐剂， 在每毫升不完全佐剂加入 1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。 配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置  4℃下保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀 生物秀论坛——资源共享、学术交流、互助社区  /bbs/  1  生物秀实验频道——生命科学实验中心 ！  /bio101/  成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗 原液 （其中加卡介苗 3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上 5～  10min 内完全不扩散为止。为避免损失抗原，亦可用一注射器装抗原液，另一注射器装 佐剂， 二者以聚乙烯塑料管连接， 然后二者来回反复抽吸， 约数十分钟后即能完全乳化。 检查合格后即以其中一注射器作注射用。 （四）免疫方法 抗原剂量，首次剂量为 300～500μg，加强免疫的剂量约为首次剂量为 1/4左右。每  2～3周加强免疫一次。加强免疫时用不完全佐剂，首次免疫时皮下注射百日咳疫苗 0.5  ml，加强免疫时不必注射百日咳疫苗。 在第 2次加强免疫后 2周，从耳缘静脉取 2～3ml血，制备血清，检测抗体效价 （见 后）。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止 （图 2­3）。当抗体效 价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。 图 2­3 抗体反应 （五）抗血清的采集与保存 家兔是最常用以产生抗体的动物，因此这里主要讨论兔血的收集。羊等较大动物以 颈静脉、动脉取血，鼠等小动物取血可参阅有关资料。取兔血有两种方法，一是耳缘静 脉或耳动脉放血，一是颈动脉入血，也可心脏采血。取动脉或静脉放血时，将兔放入一 个特造的木匣或笼内，耳露于箱 （笼）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳缘的毛，用 少许二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管扩张、充血。用手轻拉耳尖，以单面剃须刀或尖 的手术刀片，快速切开动脉或静脉，血液即流出，每次可收集 30～40ml  。然后用棉球