醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白.pdf

实验五 醋酸纤维素薄膜电泳 分离血清蛋白 王艳敏 生命科学技术学院 一、实验目的 1、学习区带电泳的基本原理 2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳操作技术 二、实验原理 带电粒子在电场中向着其电性相反的方向移动 的现象称为电泳。 蛋白质为两性电解质，在不同pH条件下，其带 电情况不同。 pH = pI 时，带电荷为零，在电场中不发生移动； pH pI 时，带负电荷，在电场中向正极移动； pH pI 时，带正电荷，在电场中向负极移动。 泳动速度除与电场强度和溶液性质有关外，主 要决定于分子颗粒的电荷量以及分子的大小与形状。 血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ- 球蛋白等，其pI低于pH7.5 ，在pH8.6巴比妥缓冲 液中，电离成阴离子 ，在电场中向正极泳动。 由于其等电点，分子量和分子形状各不相同， 其电泳速度就不同。故可将血清中蛋白质区分开来。 一般来说，蛋白质分子量小而带电荷多者，泳动速 度快，分子量大而带电荷少者泳动速度慢。 2 血清蛋白 pI 分子量(kD) 泳动度(cm /s.v) 清蛋白 4.88 69 5.9 ×10-5 α 球蛋白 5.06 200 5.14 ×10-5 1 α 球蛋白 5.06 300 4.1 ×10-5 2 β球蛋白 5.12 90 ～150 2.8 ×10-5 γ球蛋白 6.85-7.3 156 ～300 1.0×10-5 本实验采用牛血清，醋酸纤维素薄膜为支持物， 通过点样、电泳、染色、脱色从而得到血清中蛋白 的分离图谱。 醋酸纤维素薄膜具有均一的泡沫状结构，有强 渗透性，厚度约为120微米。采用醋酸纤维素薄膜 为支持物的电泳方法，叫做醋酸纤维素薄膜电泳。 该方法具有微量、快速、简便、分辨力高、对 样品无拖尾和吸附现象等优点。 三、试剂和器材 １、试剂 (1) 新鲜血清 (2) 巴比妥-巴比妥钠缓冲溶液（PH8.6 ）：称取巴比妥 1.66克和巴比妥钠12.76克，溶于少量蒸馏水后定容1000毫升。 置4℃冰箱保存，备用。 (3) 染色液 ：称取氨基黑10B 0.5克，加入蒸馏水40毫升，甲 醇50毫升和冰乙酸10毫升，混匀。 (4) 漂洗液 ：取95%乙醇45毫升，冰乙酸5毫升和蒸馏水50毫 升，混匀。 ２、器材 (1) 醋酸纤维素薄膜（2cm×8cm ） (2) 培养皿（直径15cm ）：染色和漂洗用。 (3) 盖玻片、载玻片、直尺、铅笔、镊子、普通滤纸。 (4) 电泳仪 四、操作步骤 1、泡膜和仪器准备 取2cm ×8cm的醋酸纤维素薄膜，浸入PH8.6的 缓冲溶液中浸泡30min。完全浸透后，整条薄膜颜 色一致而无白色斑点，则表明薄膜质地均匀(实验 中应选择质地均匀的膜)。 电泳槽内放适量缓冲液，使两侧液面水平。在电 泳槽的两侧支架上用四层纱布（或滤纸）搭桥，使 它的一端搭在支持版上，另一端浸入电极槽的缓冲 液内，即为“纱布桥”。 （二）、点样 用镊子轻轻取出薄膜，夹到滤纸中吸去多余的缓 冲液，注意不要吸干。使无光泽面朝上 ，距一端2cm 处用铅笔划一短直线，称为点样线。用盖玻片蘸取 微量血清 ，先在载玻片上练习点样几次，然后把盖 玻片竖直轻贴在膜的点样