荧光报告基因分析protocol.docVIP

双荧光报告基因分析 实验目的： 研究转录因子的活性和调控元件的活性。 实验原理： 通过将感兴趣的目的基因转录调控元件构建到带荧光素酶（firefly luciferase）的表达载体，如pGL3，构建成报告基因质粒然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。为避免由于质粒转细胞时效率的差异而带来的误差，可以同时转入Renilla荧光素酶的报告基因质粒作为内参Renilla以及待研究的转录因子的表达质粒共转染细胞，并根据需要刺激或处理细胞，24h-48h后收细胞。在共转染时，由于内参质粒Renilla有很强的promoter/enhancer，因此报告基因质粒:Renilla转染量一般为10：1到50：1。 3．Luciferase活性的测定（以promega的双荧光报告试剂盒为例） 3.1 细胞裂解 试剂盒中提供的裂解液为5X PLB（passive lysis buffer），使用前取1体积的PLB，加4体积的dH2O混匀。去掉细胞培养液，用PBS洗一遍以去掉残留的培液，加入1X PLB。并将培养板于摇床上室温摇15min，使细胞充分裂解。将细胞裂解液转移至ep管，12000g X 30sX 4℃离心。上清中即含有firefly luciferas 和Renilla luciferase，用于测定酶活性；而沉淀为核蛋白，可用于western blot检测转录因子的表达。 LAR II 和StopGlo LAR II（luciferase assay reagent）是firefly luciferase 的底物，在使用新的KIT时，将LAR II 溶解在 LA II buffer中，并分装保存。 StopGlo 是Renilla luciferase 的底物，同时能终止LAR II的反应。在试剂盒中提供的是50X StopGlo substrate 以及StopGlo buffer。可以一次将substrate 与buffer混匀，然后分装保存，也可以每次使用前取1体积的substrate，加入50体积的buffer。 测定 在指形管中加入40 μl 的LAR II，10 μl 细胞裂解液，用枪头上下打匀2-3次，于发光仪中测量，读数，即为firefly luciferase的值。每管依次测量完后，加入40μl StopGlo，再次测量读数，即为Renilla luciferase的值。 数据的处理 先计算出每管的firefly luciferase/ Renilla luciferase 的比值，再以control组的比值为单位1，即可得到不同处理组或转染组的相对luciferase活性，也就是该处理组基因转录的调控的活性。 实验相关试剂： Dual-Luciferase? Reporter Assay System (Promega, E1910 or E1960) 保存条件：5XPLB -20℃ LAR II 分装后于-70℃ 避光保存 StopGlo 分装后于-70℃ 避光保存 注意事项：为保证荧光素酶检测试剂的稳定性，可以采取适当分装后避光保存的方法，以避免反复冻融和长时间暴露于室温。????为取得最佳测定效果，样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制在相同时间内样品和测定试剂混合后，再进行测定。测定时间通常为10秒，根据情况也可以测定更长或更短时间，但是同一批样品最好使用相同的测定时间。由于温度对酶反应有影响，所以测定时样品和试剂均需达到室温后再进行测定。?? 附录：pGL3 图谱 图1a 图1b 图1c