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附件1：转基因定量检测标准操作程序 标准操作程序（格式） 转基因玉米MON810定量检测 标准操作程序 （SOP） 安全提示 °C备用。融解DNA样品请将其置于冰上。如果某一管样品将在一周内持续使用，请将其保存在4°C。在反应体系配制过程中，请将所有涉及的试剂和样品均置于冰上，以最大限度的保证体系的稳定性。 先进行PCR反应体系的配制和分装，以防止DNA模板的交叉污染，并在每次体系配制中设计阴性对照。如果阴性对照扩增出目的条带，则此次PCR反应视为无效。为避免气泡对PCR反应的影响，在PCR反应体系配制好后，将反应板或反应管进行1分钟离心。 2、原理 荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。TaqMan荧光定量PCR是目前应用最广泛的一种定量PCR技术。其TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，与目标序列上下游引物之间的序列配对（图1）。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA、BHQ1等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的扩增，DNA聚合酶(Taq)在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将探针水解掉，释放的5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 图1 TaqMan探针的结构和工作原理 随着反应时间的进行，到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线为了便于对所检测样本进行比较，在反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的值threshold)，值Ct值含义：荧光信号达到值所的循环数。每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 图2 实时荧光定量PCR的Ct值、阈值和标准曲线 检测限、测定低限、线性范围、回收率范围和精密度 ISO5725条款[2]或[3]，经过合作实验的满意证明或单一实验室的确认。 检测低限：在假阴性结果不超过5%的条件下，检测方法所能检测的最低浓度和含量。 精确度 ：在规定条件下所获得的独立测试结果之间的一致性。 4、仪器和设备 移液器：1000uL、100uL、10uL、2.5uL；10uL移液器可以用精确的20uL移液器替代 离心管：优质1.5mL离心管，注意使用离心管盖外侧有遮挡的管型，否则推盖时容易碰到内部，造成污染 移液器Tips：务必使用带滤芯的型号，否则在混匀和分样时非常容易污染；同时10uL和2.5uL的移液器务必使用长Tips，普通短Tips在工作时，移液器杆部可能会与离心管内壁接触，造成污染 荧光定量PCR仪： 荧光定量PCR反应管： 5、试剂与溶液 定量PCR反应用2( Master Mix：Buffer、UNG、dUTP、dNTPs、ROX等必要成分； 表1 TaqMan探针实时PCR检测引物和探针序列信息 基因 名称 序列 PCR反应体系终浓度 nM 转化事件特异性基因 正向引物 CGAAGGACGAAGGACTCTAACG 反向引物 GCCACCTTCCTTTTCCACTATCT 91 探针 FAM -CCTTTGCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTT-TAMRA 内标准基因 正向引物 CGGTGGATGCTAAGGCTGATG 反向引物 AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC 88 探针 HEX-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-TAMRA 注：标明转化事件特异性基因和内标准基因的长度 6、实验方法 6.1样品DNA的提取和质量检查 6.1.1样品DNA的提取 材料的DNA抽提采用上海市农业科学院和上海出入境检验检疫局联合研制的植物DNA抽提试剂盒，具体操作方法如下： 称取100 mg粉碎的样品转入2 mL 的离心管中；加入1mL B