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显微技术 马玉堃 生命科学学院 2007年3月 * 绪 论 电子显微镜(Electron Microscope，EM)简称电镜，是一种科学研究仪器，1932年由德国鲁斯卡(Ernst Ruska)创制。由于它的发明和运用，至今已获得了两次诺贝尔奖。 1982年英国医学研究委员会分子生物学实验室 (Medical Research Council Laboratory Of Molecular Biology)的克卢格(A．Klug)博士，获得诺贝尔化学奖，以表彰他在发展晶体电子显微学及核酸—蛋白质复合体的晶体结构方面所做出的卓越贡献.Klug和他的合作者从事病毒、染色质等的电子显微镜研究。根据显微镜成像的的傅里叶变换关系，他们发展了一整套图像处理方法，不仅改善了生物样品电子显微镜的清晰度，而且提高了它的分辨率，从而为用电子显微镜研究生物大分子的晶体结构开辟了一条新途径，开创了晶体电子显微学(Crystallographic Electron Microscopy)，不但对研究生物大分子结构有重要意义，对其它固体的晶体结构研究也有着普遍的意义。 1986年德国电子光学和电子显微镜学教授，电镜创始人鲁斯卡和扫描隧道显微镜的发明 者宾尼格(Gerdk Binning)、罗赫尔(Heinrich Rohere)共同获得了诺贝尔物理奖。奖励鲁斯卡 1931-1932年在德国柏林工科大学Max Knoll教授实验室里建成了第一台透射式电子显微镜，他在电子光学和设计第一台透射式电子显微镜方面的开拓性工作，被誉为“20世纪最重要的发明之一”。在瑞士苏黎士的国际商用机器公司(1BM)研究实验室工作的宾尼格和罗赫尔共同创造扫描隧道显微镜(Scanning Tunneling Microscope，STM)被认为是鲁斯卡首创的电十显微镜技术的最重要的发展。 光学显微镜所用的光源，基本上是在可见光范围内，它们能够分辨大于0．2μm的物体细节，优于人眼500倍。但是，小于0．2μm就分辨不清楚了。 1932年，德国Ernst Ruska制造成第一台电子显微镜，经过50年发展，投射电镜已经能分辨1.4A.比光学显微镜提高了1000倍。在电子显微镜下，不但可以看到细胞的细胞器，病毒，甚至可以看到核酸和蛋白质等生物大分子以及组成物体的基本单位——分子和原子了。 如果说17世纪光学显微镜的发明，开辟了细胞和细菌的时代，那么，20世纪电子显微镜的发明和应用，则开辟了病毒和细胞分子结构的新时代。 自1965年第一台扫描电子显微镜商品出现以来，迅速应用于各个领域，为研究结构提供了另一有力工具。 从电子显微镜发明至今半个多世纪以来，电子显微镜技术的发展和应用，对自然科学，特别是对生物学的发展，起着极其重大的推动作用。可以说，在生命科学领域中，没有一个分科不需要电子显微镜的配合。20世纪60年代前后出现的细胞生物学、分子生物学、分子遗传学、分子病理学、分子药理学、病毒学和电镜诊断学等新学科，都是以电子显微镜技术为基础和前提而发展起来的。而且，利用电子显微镜，人们已开始对细胞亚显微结构进行定性和定量分析，以及立体结构研究。 电子显微镜不但广泛地应用于生物科学的各个领域，而且也广泛地应用于物理学、化学、半导体、材料科学、考古学以及破案工作中。 从第一台电子显微镜诞生到今天电子显微术有了很大的发展，现在已经发展成为电子显微镜科学。这门科学主要包括三个方面的内容： ①各种电子显微镜的设计与制造； ②电子显微镜样品制备以及有关的各种设备； ③电子显微镜图像的分析、解释和处理。 在生物电子显微技术中，同样是研究和解决电子显微镜应用于生物学时这三方面的内容。本课程将简述电子显微镜的原理和结构，以及图像处理方法，并详细地介绍常用的各种生物样品制备技术。 第三章 透射电子显微镜的原理和结构 第一节 光学显微镜的分辨本领 由于光的衍射，一个理想的点光源(O)，经透镜L，在透镜的像平面上成像J，J不是一个完好的点像，而是一个直径有限的模糊亮盘，并为明暗交替的环所包围。如果光阑MN是圆形，那么这个盘也是圆的，称为Airy盘。如图1—1的(a，b)所示。(c)为用测微光度计测Airy盘所得到的曲线，中央亮斑称中央极大，占有全部光能量的84％，其中心是几何光学的像点。相邻的亮环称为第一、第二和第三级次极大，暗环称为第一、第二和第三级极小。Airy盘的半径通常以第一级暗环的半径厂表示。可由下列公式给出： 当有两个互相靠近的理想点光源A和B，它们的Airy盘会互相交错，强度叠加，如图1—1 (b，d)。开始可以分清两点的像，