纯化及活性测定摘要.PDFVIP

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2017-07-20 发布于湖北
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纯化及活性测定摘要.PDF

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现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2017, Vol.33, No.3 特氏杜氏藻中乙酰辅酶A合成酶的基因克隆、表达、纯化及活性测定金宏昊，梁明华，姜建国（华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）摘要：乙酰辅酶A 合成酶（ACS ）催化合成乙酰辅酶A ，它是油脂代谢和醋酸盐代谢的重要节点之一。本研究利用反转录PCR （RT-PCR ）技术和cDNA 末端快速扩增（RACE ）技术分离得到了特氏杜氏藻(Dunaliella tertiolecta) 乙酰辅酶A 合成酶（DtACS ）的 cDNA 全长(2464 bp)，预测其开放阅读框(ORF)为2184 bp ，727 个氨基酸由此段编码。序列比对显示DtACS 与绿藻ACS 最为相似（与衣藻 Chlamydomonas reinhardtii 有 68%一致；与团藻 Volvox carteri f. nagariensis 有 70%一致）。选用带有硫氧还蛋白标签（Trx-tag ）的 pET32a(+)作为原核表达载体，并将 DtACS 转入 pET32a(+) 中从而构建了pET-32a-DtACS 质粒。将其转入 BL21(DE3)感受态细胞中，同时将pET-32a 空载体也转入BL21(DE3)感受态细胞中，分别得到重组菌pET-32a-DtACS-BL21(DE3)和对照菌种pET-32a-BL21(DE3) 。将重组菌在 18 ℃、终浓度为 0.6 mmol/L 的IPTG 条件下诱导 12 h，表达出来的带有 Trx-His 标签融合蛋白的 DtACS 约为 8.74 ku （6.99 ku+1.75 ku ）。此外，将表达得到的重组蛋白经Ni2+亲和层析柱纯化，纯化后蛋白比活力为 52.87 U/mg。关键词：乙酰辅酶A 合成酶；特氏杜氏藻；基因克隆；纯化；比酶活文章篇号：1673-9078(2017)3-67-73 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2017.3.011 Cloning, Expression, Purification, and Activity Assay of Acetyl-CoA Synthetase from Dunaliella tertiolecta JIN Hong-hao, LIANG Ming-hua, JIANG Jian-guo (College of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China) Abstract: Acetyl-coenzyme A (CoA) synthetase (ACS) catalyzes the synthesis of acetyl-CoA and is one of the important hubs of fat and acetate metabolism. In this study, reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and rapid amplification of cDNA ends (RACE) techniques were used to obtain ACS cDNA from Dunaliella tertiolecta (DtACS). The cDNA contained 2,464 base pairs (bp) (full-length). The predicted length of open reading frame (ORF) was 2,184 bp