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第六章 动物人工繁殖 为什么要进行动物人工繁殖？ 大熊猫是我国的国宝，是国家一级保护动物，系濒危物种。 野外大熊猫到了圈养环境中繁殖率非常低，78%的雌性大熊猫不孕，90%的雄性大熊猫不育。 我国20世纪末实行了大熊猫人工繁殖计划。 对于人类，世界范围内不孕夫妇占10％左右，需要建立人工助孕技术。 主要内容： 体外受精动物（试管动物、试管婴儿） 核移植动物（克隆动物） 关键问题： 体外受精动物的培育：精子获能与卵细胞成熟培养、体外受精方法、性别控制的原理与方法 核移植动物的培育：核移植、重组胚的激活 第一节 体外受精 一、定义 体外受精：将哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中（温度、湿度、气体、渗透压、酸碱度等）完成受精过程的技术。 体外受精动物：也称试管动物，是指将供体的精子和卵子在体外受精，体外培养胚胎发育到一定阶段通过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。 与人工授精的区别 世界上首批试管动物 1959年，张明觉以家兔为实验材料，从一只交配后12h的母兔子宫中冲取精子(即体内获能的精子)，从另外两只超数排卵处理母兔的输卵管中收集卵子，精子和卵子在体外人工配制的溶液中完成受精过程。然后，正常卵裂的36枚胚胎被移植到6只受体的输卵管中，其中4只妊娠，并产下15只健康仔兔，这是世界上首批试管动物。它们的正常发育标志着体外受精技术的建立。 二、意义 发挥优良母畜的繁殖潜力 促进家畜改良的速度 保存遗传资源 三、知识回顾 四、试管动物培育流程 （1）精子采集与体外获能、卵子采集与成熟培养 （2）体外受精 （3）胚胎体外培养 （4）胚胎移植：是指将受精卵或发育到一定阶段的胚胎移植到与供体同时发情排卵、但未经配种的“受体”母畜输卵管或子宫的技术 （5）体内发育、出生 1、精子的采集与体外获能处理 采集：精子上游法采集，在精液上面加入少量培养液，有活力的精子游到表面，收集。 精子获能：指精子获得穿透卵子透明带能力的过程。 精子的顶体反应：遇到卵子时，精子头部“顶体”脱落，顶体酶释放，使卵子的放射冠和透明带溶解，精子进入卵细胞，达到受精的目的。 体内获能： 雄性精液中含有“去能因子”（大多为糖蛋白），附在精子表面，是顶体酶的抑制剂，抑制了精子的受精能力。 “去能因子”的清除主要依靠宫颈、子宫及输卵管液中的β-淀粉酶、胰蛋白酶、 β-葡糖苷酶、唾液酸酶等，水解糖蛋白等“去能因子”，使精子顶体酶活性恢复，具有受精能力。 体外获能： 1951年，美籍华人张明觉和澳大利亚人Austin同时发现了哺乳动物的精子获能现象。 20世纪60年代初至20世纪80年代中期，人们以家兔、小鼠和大鼠等为实验材料，进行了大量基础研究，在精子获能机理和获能方法方面取得很大进展。 人工使精子获能有两种方法： 培养法：是用人工配制的获能液 化学诱导法：是用一定浓度的肝素或钙离子载体诱导 2、卵子的采集与成熟培养 采集方法： 离体卵巢采卵：是从屠宰母畜的卵巢采集 活体采卵：从活母畜的卵巢采集卵母细胞（优良品种） 需要对卵母细胞进行选择 超数排卵：人为注射外源促性腺激素，促使卵巢排出较正常情况下更多的成熟卵子。 成熟培养：卵母细胞需要在体外培养成熟才能进行受精。 培养液：氨基酸、维生素、激素、供能物质、大分子营养物质等。 常用：TCM199培养基，添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素、抗生素等。 温度和气相： 牛、猪、羊和马等家畜一般为38～39； 要求在含5％C02的空气，100%相对湿度。 培养时间： 牛、羊：一般为22～24h； 马为30～36h； 猪为40～44h。 3、体外受精 精子发生顶体反应时，精子顶体外膜与其相贴的卵细胞膜发生多点融合而破裂，继而出现小孔。 顶体酶就是通过这些小孔释放出去，使卵细胞周围的卵丘细胞分散并去除放射冠，分解透明带。 精子顶体内膜与卵细胞膜相互融合，最终雄性原核和雌性原核合二为一，完成受精过程。 共同培养：一般将成熟的卵母细胞和获能的精子在一个合适的体外环境条件下共同培养一段时间，就能完成体外受精。 受精过程所采用的培养液与动物细胞培养用培养液类似，但需添加一些特殊物质，如肾上腺素、亚牛黄酸、肝素等，它们有助于精子穿卵和促使原核的形成。 精子和卵子常在小滴中共培养，每滴大约10万个精子，2-3个卵细胞，放入5% CO2，37℃培养箱进行培养。 受精成功观察：将含有受精卵的培养皿放置于倒置显微镜下，卵细胞内出现两个雌雄原核，标志着受精成功。 体外受精方法： 卵浆内精子注射法：用微注射器将单个精子直接注射入卵子内。 该技术可排除透明带甚至质膜对精子入卵的阻碍作用，故对精子的死活及其完整性无严格要求，因此，该技术对动物受精