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检样量的选择 注1：本表采用3个稀释度[0.1 g(mL)、0.01g(mL)和0.001 g(mL)]，每个稀释度接种3 管。 注2：表内所列检样量如改用1 g（mL）、0.1g(mL)和0.01 g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01 g(mL)、0.001 g(mL)、0.0001 g(mL)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。 大肠埃希氏菌平板计数法（第二法） 制订依据 美国食品药品管理局（FDA）：Bacteriological Analytical Manual ，2002，Chapter 4：Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria 基本原理 4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷，英文缩写MUG。是一种不产生荧光的底物。由于96%的大肠埃希氏菌都具有葡萄糖醛苷酸酶，能分解β-D葡萄糖醛苷，而使4-甲基伞形酮游离出来，在366 nm紫外光下产生蓝色荧光。观察到蓝色荧光即可认为是大肠埃希氏菌阳性。MUG对大肠埃希氏菌的生长繁殖既没有抑制作用也没有促进作用，对菌落形态也没有影响。 大肠埃希氏菌平板计数法程序 检样25g(mL)+225mL稀释液 均质10倍系列稀释 选择2~3个适宜稀释度的样液，接种VRBA-MUG平板 36℃±1℃ 18~24h 紫外光照射，计数发荧光菌落 报告结果 6.2 操作步骤 6.2.1 样品的稀释，按5.2.1进行。 6.2.2 平板计数 6.2.2.1 选取2个～3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL稀释液加入无菌平皿做空白对照。 6.2 操作步骤 6.2.2.2 将10 mL～15 mL冷至45℃±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。 6.2.2.2 …待琼脂凝固后，再加3mL～4 mL VRBA-MUG覆盖平板表层。凝固后翻转平板，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。 6.3平板菌落数的选择 数在10 CFU～100 CFU之间的平板，暗室360nm～366nm 波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。 6.2 操作步骤 检验时用已知MUG阳性菌株（如大肠埃希氏菌ATCC25922）和产气肠杆菌（如 ATCC 13048）做阳性和阴性对照。 6.4 大肠埃希氏菌平板计数的报告 两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌数，以CFU/g (mL)表示。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。 质量控制 人员培训 标准菌株：大肠埃希氏菌ATCC 25922， 产气肠杆菌ATCC 13048 消耗性材料技术性验收 大肠埃希氏菌在VRBA上 大肠埃希氏菌在EMB上 大肠埃希氏菌在EMB上 谢 谢！ 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * GB 4789.38－2012食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数 参考标准 本标准采用的定义是大肠埃希氏菌，方法主要参考的是美国FDA Bacteriological Analytical Manual（2002）中的Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria。 VRBA－MUG平板计数法 MUG对大肠埃希氏菌的生长繁殖没有抑制作用也没有促进作用，对菌落形态也没有影响。经实验发现，在MUG浓度从0 ?g/mL到200 ?g/mL的范围内，大肠埃希氏菌生长繁殖率没有区别。 MUG方法有大约4%的假阴性，特别是倍受关心的O157:H7菌株为阴性，令人感到遗憾，但经典的常规方法也同样存在这样的问题。 VRBA－MUG平板计数法 常规方法不能检出不产气菌株和乳糖迟缓发酵菌株，而且由于O157:H7菌株不能耐受44℃的培养温度而同样不能检出O157:H7菌株，普通变形杆菌等某些杂菌的存在对大肠埃希氏菌发酵乳糖的产气能力具有抑制作用，但对分解MUG产生荧光的能力没有抑制作用。 VRBA－MUG平板计数法 研究还证实，大肠埃希氏菌荧光反应比产气反应出现得更早，并且不受食品的影响，仅发现对牡蛎直接进行的检验不适合用MUG方法，因为牡蛎具有内源性葡萄糖苷酸酶。 VRBA－MUG平