木瓜蛋白酶特性的测定.docVIP

木瓜蛋白酶性质测定 一、实验目的 1、学习并掌握木瓜蛋白酶活性测定的基本原理。 2、掌握影响木瓜蛋白酶性质的不同因素，如激活剂(如EDTA、半胱氨酸)，抑制剂、pH 等。 二、实验原理 木瓜蛋白酶（Papain）是一种巯基蛋白酶，它分解比胰脏蛋白水解酶更多、更广泛的蛋白底物。它也具有脂酶活力。其分子量约为23 000 左右。木瓜蛋白酶是单条肽链，由211个氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝，酶分子只有1 个巯基，对酶活力是必需的，激活剂有半胱氨酸、硫化物、亚硫酸盐和 EDTA等；抑制剂有巯基试剂，包括重金属、羧基试剂和过氧化氢等。 酪蛋白是一种蛋白质，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区275 nm 处有吸收峰，根据测定275 nm 处的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说木瓜蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。 三、仪器和试剂 1、市售木瓜蛋白酶； 2、仪器设备：磁力搅拌器（机）；离心机7000rpm（冷冻式）；紫外分光光度计；水浴槽；冰箱及常规玻璃仪器。 四、实验步骤 （一）激活剂（EDTA）对木瓜蛋白酶活力的影响 1、试剂 （1）3 mg·mL-1 木瓜蛋白酶液（用 0.1 mol/L 的磷酸缓冲液，pH 7.2 配制）； （2）0.1 mol·L-1的磷酸缓冲液，pH 7.2 ； （3）激活剂：用 0.1 mol·L-1 磷酸缓冲液（pH 7.2）配制含10 mmol·L-1半胱氨酸，分别含有0，0.2，0.6，1.0，2.0，4.0 mmol·L-1 EDTA 的6 种混合液 ； （4）1%酪蛋白溶液：用0.1 mol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.2）配制 ； （5）15%三氯乙酸（TCA）溶液。 2、方法 EDTA 浓度 （mmol·L-1） 0 0.2 0.6 1.0 2.0 4.0 管 号 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 酶 液（mL） 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 EDTA（mL） 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 37 ℃水浴预热10 min 1%酪蛋白（mL） 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 37 ℃水浴10 min TCA（mL） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 1% 酪蛋白（mL） 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 摇匀，静置5 min 过滤（或离心） A275nm 0 2.028 0 2.036 0 2.055 0 2.137 0 0.578 0 0.082 （二）抑制剂（过氧化氢）对木瓜蛋白酶活力的影响 1、试剂 配制浓度分别为0，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0mmol·L-1 的过氧化氢溶液。 2、方法 过氧化氢浓度 （mmol·L-1） 0 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 管 号 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 酶 液（mL） 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 过氧化氢 （mL） 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 37 ℃水浴预热10 min 1%酪蛋白 （mL） 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 37 ℃水浴10 min TCA（mL） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 1% 酪蛋白 （mL） 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 摇匀，静置5 min 过滤（或离心） A275nm 0 1.595 0 1.505 0 1.500 0 1.445 0 1.035 0 1.330 （三）不同pH 值对木瓜蛋白酶活力的影响 1、试剂 pH 5.0 缓冲液 0.1 mol·L-1 乙酸－乙酸钠缓冲液； pH 6.0 缓冲液 0.1 mol·L-1 磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液； pH 7.0 缓冲液 0.1 mol·L-1 磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液； pH 8.0 缓冲液 0.1 mol·L-1 磷酸氢二钠－磷酸二