的粗提取与鉴定修改.pptVIP

* §5.1 DNA的粗提取与鉴定 一、基础知识 （一）提取DNA的方法 1.提取生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。 2.提取DNA的基本思路 提取DNA，去除其他成分 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异 ⑴ DNA的溶解性 DNA和蛋白质等成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀；或者让其他成分溶解，DNA析出。 3.DNA等大分子的理化性质 ⑵ DNA不溶于酒精溶液 DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。将DNA与蛋白质进一步分离。 ⑶ DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 ① 蛋白酶——水解蛋白质，对DNA没有影响 ② 高 温——大多数蛋白质不能忍受60～80℃ 而DNA在80℃以上才会变性 ③ 洗涤剂——溶解细胞膜，去除脂质和蛋白质 但对DNA没有影响 （二）DNA的鉴定 沸水浴条件下，DNA遇二苯胺被染成蓝色。 二、实验设计 （一）实验材料的选取 从下列材料中选取2～3种 原则： 菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜； 鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞； 在液体培养基中培养的大肠杆菌 凡是含有DNA的生物材料都可以考虑 选用DNA含量相对较高的组织 要容易取得、细胞分散或容易分散、细胞容易破碎或容易研碎、细胞核中的DNA容易释放。 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 1、动物细胞 ——容易破碎 鸡血细胞溶液： 加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液。 蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分大量进入血细胞，使血细胞胀裂； 加上搅拌作用，加速鸡血细胞细胞膜、核膜破裂，从而释放出DNA。 2、植物细胞 ——需要溶解细胞膜 ① 加入一定的洗涤剂和食盐 ② 充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液 洗涤剂——离子去污剂，能溶解细胞膜，利于DNA释放 食 盐——NaCl，利于DNA的溶解于研磨液中。 研磨不充分，核内的DNA释放不完全，提取的DNA量少，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。 为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理。 讨论：滤液/研磨液中可能含有哪些成分？ 可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质 1. DNA的溶解性 2. DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 （三）除去滤液中的杂质 利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的DNA与蛋白质分开； 利用DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，使蛋白质变性与DNA分离。 为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？ （四） DNA的析出与鉴定 与滤液体积相等的冷却的酒精溶液(体积分数95％)， 静置2－3min，溶液中会出现白色丝状物。 ——粗提取DNA 1、DNA的析出 用玻璃棒沿一个方向搅拌，（以利于DNA分子的附着和缠绕）卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水。 2. DNA的鉴定 ⑴ 向两支试管中分别加入 2mol/L NaCl 溶液5ml ⑵ 其中一支试管中加入DNA丝状物 ⑶ 各加入二苯胺试剂4ml ⑷ 混匀后，置于沸水浴中加热5min ⑸ 待冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化 观察现象：溶解丝状物的溶液变为蓝色 观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多； 二苯胺鉴定出现蓝色，说明实验基本成功， 如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备 1、请解释提取DNA的实验操作中主要的步骤的目的。 （1）材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难； （2）DNA的释放和溶解，是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解； （3）DNA的纯化，根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开； （4）对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。 共有“三次过滤，两次析出，七次搅拌” 加入“两次蒸馏水，三次NaCl溶液，一次酒精” A出现蓝色，B无变化 (1)向两支试管中各加入2 mol／L的NaCl溶液5mL (2)将丝状物放入A试管中，搅拌使其溶解 (3) 向两支试管中各加入4 mL二苯胺试剂。 混合均匀后沸水浴5min 9.DNA的鉴定 DNA不溶于酒精，出现沉淀 冷却的95％的酒精50 mL 8.提取含有杂质较少的DNA 除去含DNA的滤液中的杂质 7.过滤含DNA的NaCl溶液 同3 2 mol／L的NaCl溶液 6.将DNA的黏稠物再溶解 使含DNA的黏稠物留在纱布上 5.滤取含DNA的黏稠物