三、叶绿素含量的测定等.pptVIP

实验三、?叶绿体色素含量的测定（分光光度法 和SPAD叶绿素仪法 ） 高等植物在光合反应中吸收光能的主要色素为叶绿素 ,其含 有的叶绿素 a和叶绿素 b能将光能转化为化学能 ,形成有机物质。因此 ,叶片中叶绿素含量的高低是反映植物叶片光合能力的一个重要指标。 一、目的: 了解分光光度计和SPAD叶绿素仪的使用方法；理解分光光度计测定叶绿体色素含量的实验原理；掌握计算叶绿体各色素成分含量的方法。 　　　　　　　　　　　　 * 要求： 2、问答题： （1 ）Lambert-Beer定律又叫什么定律？列出其数学表达式（并说明各符号的代表意义）。 Lambert-Beer 定律中的比例系数“K ”的物理意义是 ……？ Lambert-Beer 定律本身是否有局限性？何谓吸光度的加和性？ （2 ）叶绿素在兰光区的吸收峰高于红光区的吸收峰,为何不用兰光区的光吸收来测定叶绿素的含量？ （3）本实验为什么要用光路宽度为1cm的比色杯？ * 二、原理 叶绿素提取液中同时含有叶绿素a 和叶绿素b,二者的吸收光谱虽有不同, 但又存在着明显的重叠（如图）,在不 分离叶绿素a和叶绿素b的情况下同时测 定叶绿素a和叶绿素b的浓度,可分别测 定在665nm和649nm的光吸收, 由于在 该波长时叶绿素a、b的比吸收系数K为 已知，我们即可以根据Lambert-Beer 定律,列出浓度C与光密度D之间的关系 式： D665=83.31Ca+18.60Cb……….(1) D649=24.54Ca+44.24Cb……….(2) 从而计算出提取液中叶绿素a和叶绿素b 的浓度. 叶绿素a、b的比吸收系数 波长(nm) 叶绿素a 叶绿素b 665 83.31 18.60 649 24.54 44.24 注：(1)(2)式中的D665、D649为叶绿素溶液在波长665nm和649nm时的光密度。叶绿素a、b的浓度单位为：g/L * 解方程式(1)(2)，则得： Ca=13.7 D665—5.76D649 ………(3) Cb=25.8 D649—7.6 D665………..(4) G总=Ca+Cb=6.10D665+20.04D649………(5) 注：此时，Ca、Cb为叶绿素a、b浓度，单位为:mg/L，利用上面（3）（4）(5)式，即可以计算叶绿素a、b含量及总叶绿素的总含量(G总)。 * 二、材料：　　大红花老叶和嫩叶 三、实验步骤 1. 取新鲜大红花叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。 2. 称取剪碎的新鲜样品0.5g，放入研钵中，加少量碳酸钙和石英砂及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，暗处静置3～5min。 3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。 5. 把叶绿体色素提取液稀释5倍后倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为参比，在波长665nm、649nm下测定光密度。 * 四、实验结果计算 将测定得到的吸光值代入下面的式子： Ca=13.7 D665—5.76D649 ………(3) Cb=25.8 D649—7.6 D665………..(4) G总=Ca+Cb=6.10D665+20.04D649………(5) 分别计算叶绿素a、b和总叶绿素的含量 Chl（mg/g.FW）= * 原理： SPAD-502 叶绿素仪通过测量叶片在两种波长光学浓度差方式650nm 和940nm来确定叶片当前叶绿素的相对数量。 测量值是通过对在二个不同波长区域，叶片传输光的数量进行计算，在这二个区域叶绿素对光吸收不相同的。这二个区域是红光区(对光有较高的吸收且不受胡萝卜素影响)和红外线区(对光的吸收极低) 开机 调零 测量1 测量2 测量3 求平均值 * 一 分光光度计的工作原理： 分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。 * 二 分光光度计的基本常识： 1、紫外光分光光度计，其使用波长在190－400nm,可见光分光光度计，其使用波长在400－800nm。 2 消光系数：是溶液对光吸收的比例常数，指在一定的浓度和波长等条件下物质的光吸收值，用K表示。它取决于溶质性质、入射光波长和温度。 消