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Western blot 转膜及膜的选择 转膜： 经过PAGE电泳分离后的蛋白质样品需要经过“转膜”步骤——从PAGE 胶转移到膜上固定，才能用各种方法进行Western Blot的检测和显色，而且为 了防止没有电场的情况下已经分离的蛋白条带扩散，转移要尽快进行转膜的首要 是选膜。在转移膜上显色其实就像是画家在画布上作 画一样，不光要有好的画 笔和颜料，适合的画布也是相当之重要。Western Blotting亦是如此，没有选 择好合适的转移膜是无法做出漂亮的结果的。因此，选择适合的转移膜，要让转 移“膜”高一尺，帮衬而不是阻碍到我们的实 验。 Western Blot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜（Nitrocellulose Blotting Membranes，NC）和PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride） ，此外也 有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。具体哪种膜适合于哪些实验呢？选择 的根据主要有：a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜 能结合 蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色 检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.如果后继实验有 其他 要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜， 就像国画要选择宣纸，油画要挑亚麻布或薄棉扣布一样。 转膜 是对western blot 最终结果影响最大的一步，转膜质量的好坏直接决定了 实验结果的好坏。转膜的影响因素不多，主要有膜的选择、转印方法和实验操作 三个方面。 首先是膜的选择问题。膜的选择主要从实验目的和实验要求来考虑。例如， 要做分子量小于20kDa的小蛋白，0.45um的NC膜是不可取的，因为这样可能会 使得蛋白因透过膜孔而造成膜结合的目的蛋白量不确定，从而影响到最终结果的 可靠性。而如果所分离的蛋白需要进行测序，则非PVDF膜不可，因为只有PVDF 膜才能经受住严酷的清洗条件。常用的western blot用膜有NC膜、PVDF膜和 尼龙膜，它们的一些主要的特点总结如下表： NC膜 尼龙膜 PVDF膜 灵敏度和分辨 高 高 高 率 背景 低 较高 低 125－200 ug/cm2（适合于SDS 结合能力 80－110 ug/cm2 400 ug/cm2 存在下与蛋白质的结合） 材料质地 干的NC膜易脆 软而结实 机械强度高 溶剂耐受性 无 无 有 操作程序 缓冲液润湿,避免气泡 缓冲液润湿 使用前100%甲醇润湿 常规染色， 比较于NC膜，可 常规染色，可用放射性和非 不能用阴离子 检测方式 用考马斯亮蓝染色，可用于ECL 放射性检测 染料 检测，快速免疫检测。 0.45um 一般蛋白 低浓度小分子 0.2um一分子量小于20kD 蛋白、酸性蛋 适用范围 蛋白 白、糖蛋白和蛋 糖蛋白检测和蛋白质测序 0.1um一分子量小于7kD蛋 白