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关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结??ChIP实验原理??在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。?可以利用ChIP研究转录因子（?transcription?factor,?TF）与启动子（promoter）的关联性。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。?一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein?A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。???ChIP实验步骤??第一天：?（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。?1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul?37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml）?2、37摄氏度孵育10min。?3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。?450ul?2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。?4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。?5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm?5min收集细胞。?6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS?Lysis?Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。?假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul?SDS?Lysis?Buffer。?将2管混在一起，共800ul。?7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。当然，如果实验室有Bioruptor这种神器的话那就轻松了。???（二）、除杂及抗体哺育。?8超声破碎结束后，10000g?4度离心10min。去除不溶物质。留取300ul做实验，其余保存于－80度。?300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul?5M?NaCl?（NaCl终浓度为0.2M），65度处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。?9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul?ChIP?Dilution?Buffer。?再各加入60ul?Protein?A?Agarose/Salmon?Sperm?DNA。4度颠转混匀1h。?10，1h后，在4度静置10min沉淀，700rpm离心1min。?11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul?抗体，另一管中则不加抗体。4度颠转过夜。??（三）、检验超声破碎的效果。?取100ul超声破碎后产物，加入4ul?5M?NaCl，65度处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。??第二天：?（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。?12、孵育过夜后，每管中加入60ul?Protein?A?Agarose/Salmon?Sperm?DNA。?4度颠转2h。?13、4度静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。?14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。?洗涤溶液：a.?low?salt?wash?buffer----one?wash?b.?high?salt?wash?buffer-----one?wash?c.?LiCl?wash?buffer------one?wash?d.?TE?buffer------two?wash?15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul?10％SDS，?100ul?1M?NaHCO3，?800ul?ddH2O，共1ml。?每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。?16、解交联：每管中加入20ul?5M?NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。?混