人源性抗bFGF单链抗体表达载体的构建与酵母表达.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（５）：３１３５ 人源性抗ｂＦＧＦ单链抗体表达载体的 构建与酵母表达 １ １ １ １ ２ １ １ 吕卫东 　杜超超 　王　宏 　姜浩武 　劳学军 　宋其芳 　邓　宁 （１广东省分子免疫与抗体工程重点实验室 暨南大学抗体工程研究中心　广州　５１０６３３　２暨南大学第一临床学院　广州　５１０６３２） 摘要　为了提高人源性抗ｂＦＧＦ抗体的表达量，从噬菌体抗体库筛选出的人源性抗ｂＦＧＦ抗体基 因中亚克隆单链抗体（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎｆｒａｇｍｅｎｔｖａｒｉａｂｌｅ，ＳｃＦｖ）基因，并将其构建到酵母表达载体 ｐＰＩＣＺＡ中。表达载体质粒经线性化后，电转化法转化至毕赤酵母ＧＳ１１５中，甲醇诱导表达。表 α 达产物经镍离子亲和层析和阴离子交换层析纯化，并检测其生物学活性。酶切鉴定结果显示人 源性的酵母表达载体构建成功。ＳＤＳＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示，抗ｂＦＧＦ单链抗体获得了高 效表达，表达量可达１２４ｍｇ／Ｌ，目的蛋白大小为３６ｋＤａ左右。通过两步纯化方案，目的蛋白的纯 度可达９５％以上。ＥＬＩＳＡ结果显示纯化的目的蛋白可与 ｂＦＧＦ特异性结合。ＣＣＫ８检测结果显 示，纯化的抗ｂＦＧＦ单链抗体可剂量依赖性地抑制人肺腺癌细胞株Ａ５４９的增殖。研究结果表明 在毕赤酵母中可获得人源性抗ｂＦＧＦ单链抗体高效表达，表达产物具有很好的生物学活性。 关键词　ｂＦＧＦ　单链抗体　毕赤酵母　肺癌 中图分类号　Ｑ７８９ 　　肿瘤的形成、发展和转移高度依赖于血管，因此通 有组织穿透性强，免疫原性低，清除快，易于大量制备 过抑制肿瘤血管的生成可间接的抑制肿瘤的生长，并 等优点，因此在应用中更具优势。本实验室前期通过 且研究表明抗血管生成药物可以明显的增强放化疗效 噬菌体展示技术筛选到的一株人源性中和性抗体，体 ［１］ 外实验表明该人源性抗体能够抑制ｂＦＧＦ对ＨＵＶＥＣ细 果 。碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ），又名成纤维 细胞生长因子２（ＦＧＦ２），是一种重要的促血管生成因 胞的促增殖作用，同时还能抑制肿瘤细胞（Ｕ８７ＭＧ）的 ［７８］ 子，在肿瘤的发生发展中起着重要作用。肿瘤细胞中 增殖 。为提高该抗体的表达量本研究从该抗体库 存在ｂＦＧＦ的高表达，通常比正常细胞高 １０倍以上， 中亚克隆单链抗体基因并将其构建到酵母表达系统中 ｂＦＧＦ还与血管内皮生长因（ＶＥＧＦ）、ＰＤＧＦ等具有协同 进行高效表达，通过纯化后进一步研究其生物学活性。 ［２４］ 促进血管新生和促进肿瘤生长的作用 。而且ｂＦＧＦ １　材料与方法 还能直接作用肿瘤细胞，促进肿瘤细胞的增殖和加速 ［５］ １．１　材　料 肿瘤细胞的侵润和转移 。在肺癌中ｂＦＧＦ不仅高表 　　人肺腺癌细胞株Ａ５４９，Ｅ．ｃｏｌｉ菌株 ＤＨ５、毕赤酵 达，并且与肺癌的侵袭性和进展程度密切相关，在肺癌 α 母菌株 ＧＳ１１５及表达载体ｐＰＩＣＺＡ为本室常规保存； 的发展中起到促进肿瘤增殖和肿瘤血管生长的作用， α ［６］ 质粒ｐＣＯＭ３Ｘ１Ａ由本实验室前期构建；限制性内切 并且对预后评估有一定的参考价值 。所以研制高亲 和力的ｂＦＧＦ人源性抗体具有显著的意义。