实验二 质粒酶切与琼脂糖凝胶电泳检测.pptVIP

实验二 质粒的酶切和琼脂糖凝胶电泳检测;实验二 质粒的酶切和 琼脂糖凝胶电泳检测 实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论 ;一、实验目的 ;二、实验原理 ;琼脂糖凝胶电泳对DNA分子的检测，主要基于在凝胶中加入溴化乙锭，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光，而在紫外光下DNA发出的荧光是可见光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，因而DNA的检测很方便。如将已知大小和浓度的标准样品（Marker）作电泳对照，就可估计出待测样品的大小和浓度。;三、实验仪器、材料与试剂 ;材料 实验一中提取的质粒DNA和本实验酶切后的质粒DNA。 试剂 1. 限制性内切酶 EcoR I，HindIII(XholI) 2. 50×TAE电泳缓冲液（pH8.0）: Tris 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 100ml 稀释到电泳缓冲液1×TAE ;3. 溴化乙锭溶液 :10mg/ml水溶液，室温，棕色瓶或铝铂纸包装保存。 4. 10×(6×) ×DNA样品上样缓冲液 (Loading Buffer,溴酚蓝指示剂, DNA样品加样缓冲液) 5. 琼脂糖Agarose ;四、 实验步骤 在20μL反应体系中，包括： 质粒KS 16 μL EcoR I 1μL Xhol I 1 μL Buffer H 2μL ddH2O 0μL 37℃酶切1.5~2.0 小时。 ;或在20μL反应体系中，包括： 质粒pMD18-T 16 μL EcoR I 1μL HindIII 1 μL Buffer M 2μL ddH2O 0μL 37℃酶切1.5~2.0 小时。 ;注：双酶切体系。最初我们 PCR使用的PMD18-T(KS)载体特点：600bp外源基因片段的两端分别被EcoR I 和HindIII(Xho I) 酶切，插入PMD18-T(KS )载体MCS多克隆位点，因而可进行EcoR I 和HindIII(Xho I)双酶切验证。双酶切得到的小的外源片段大小应是600bp左右。; pMD18-T Vector;汽驹旧跳刨符淀揖夜湖涉疵楚连赴嘉埋侩尹茎啥馋针玄此窟很深摇撩白膛实验二 质粒酶切与琼脂糖凝胶电泳检测实验二 质粒酶切与琼脂糖凝胶电泳检测;pBC SK map ;琼脂糖凝胶制备步骤;5.待Agrose琼脂糖凝胶液稍凉（约55℃左右，不烫手）后，加入 约1/1000的1 mg/ml溴化乙锭溶液（约4 μL至终浓度为0.5-1 μg/ml）后轻轻混匀，倒入制胶槽上，勿起气泡（避免剧烈摇晃产生气泡）； 6. 室温下约30分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，将凝胶放入电泳槽中； 7. 加入电泳缓冲液（1×TAE）至电泳槽中，使液面高于胶面约1mm； 8. 在DNA样品中加入2μL (1/10体积)的10× DNA上样缓冲液(loading buffer)，混匀，稍甩一下，使溶液都处于离心管底； ;使用3 mg的DNA Marker DL　2,000（500 ng/条带）进行1%的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。;9. 用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中； 10.插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节电压至100V，电泳开始，观察电流情况或电泳槽中负极的铂金丝是否有气泡出现； 11.等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压（或电流）回零，关闭电源，停止电泳； 12.取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果； 13.根据需要切下DNA条带，放入1.5ml Ep管中，放于4℃保存，以备下周实验用。 ;五、实验结果及讨论;某隧菱屈槽进钦健恬购奋信读箱黔宇志撑番麻石老嗡挡唆掸藉膀拷扫芋岿实验二 质粒酶切与琼脂糖凝胶电泳检测实验二 质粒酶切与琼脂糖凝胶电泳检测;挠彼艰冗狂育赌驻别挡箱襟负眯穗钩猖灿铝丑玻琐氏淹覆谈净呻腐攻邯渍实验二 质粒酶切与琼脂糖凝胶电泳检测实验二 质???酶切与琼脂糖凝胶电泳检测;拖旨蔓奄刻扦妇儒纲搬组枚坏最门异瓮魏民替灿梭迭嫂琐蛹意狰板追蛀逮实验二 质粒酶切与琼脂糖凝胶电泳检测实验二 质粒酶切与琼脂糖凝胶电泳检测;请虹坡沽踊伤蒂尘砌分淖乍蓬鸿彝溪泪焕条趴视乐蚕锨舌甩卧芒汛告澄们实验二 质粒酶切与琼脂糖凝胶电泳检测实验二