免疫组化理论课.ppt

免疫组织化学基本技术（2）;免疫组化技术操作并不困难，虽然染色过程包括很多步骤，但只要注意一些主要问题，就能完成一张质量好的免疫组化切片。 ;内 容;免疫组化基本流程;染色前需注意的问题;染色中应注意的问题;一、脱蜡和水化 ;二、抗体选择; 首先确定一抗种属来源能否适应标本来源（人或动物组织），能否适应标本处理形式（冰冻、石蜡），一抗单克隆抗体（鼠、兔）和多克隆抗体（兔、马、羊等）及二，三抗的配套连接，不同方法连接方式不同（S-P、二步法等），购买商品化抗体应尽量购买原液，质量高，保存时间长，而即用型抗体则现买现用，不可长期保存。 ;多抗和单抗的比较; 主要有两大类： 1、多克隆抗体：为针对多个抗原决定簇的抗 体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。 2、单克隆抗体：为一个B淋巴细胞分化增殖产 生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异 性强。 ;抗体的稀释方法; 抗体的最佳稀释度 由于各种抗体效价不同，组织中抗原强弱不一，应根据不同情况作适当的调整，以取得中等阳性稀释度为最佳，因其既适合于抗原性强和含量多的标本，也可用于抗原性弱的标本。;抗体滴片技术 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。 滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。 要领：甩净组织周围的水。;三、抗原修复 ; 常规甲醛固定的石蜡切片标本在固定过程中会形成醛键，导致蛋白交联封闭了组织中的部分抗原决定簇，染色前需进行处理，打开醛键暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以使抗体和抗原最大限度结合，提高免疫组化检测阳性率，达到能真实反映该组织蛋白表达水平或抗原含量。抗原修复有酶消化、微波修复、高压处理等。;1、微波修复;;子宫内膜PR染色，修复良好 子宫内膜PR染色，修复不足;2、酶消化 ;胰蛋白酶，用于胞浆抗原，此酶较温和，浓度及消化时间易控制，常用0.05%~0.1%, PH7.8, 37℃消化20~30′ 或更长，微波37℃可短时消化。 胃蛋白酶，用于间质抗原，常用0.2% PH2.5左右，消化20~30′或更长，消化后切片应充分洗涤，否则对组织中抗原会进行缓慢消化，破坏组织结构;;;3、高压处理; 加热处理后免疫组化的染色敏感度大幅度地提高，其机理推测可能是加热打开了组织抗原因福尔马林固定所引起的抗原决定簇的交联，但机理目前仍然还不是十分清楚。;;;4.抗原修复液的选择 ;值得注意的是没有一种抗原修复液能适合于所有的抗体，柠檬酸缓冲液（pH6.0）可作为免疫组化常规使用的抗原修复缓冲液，但也不能除外某些抗体适用于EDTA和Tris缓冲修复液，一般抗原比较难于表达的抗体多选择EDTA和Tris缓冲修复液。;四、内源性过氧化物酶的灭活;蜕膜组织部分胞核PR阳性，血管内红细胞过氧化物酶显色;坏死组织着色 ;内源性生物素—肾小管 ;IgG交叉反应常引起非特异性背景着色，因不同种系动物分子结构相似，抗一种动物IgG可与另一种动物IgG交叉反应，如：二抗羊抗鼠或羊抗兔血清可与人组织切片上人IgG结合，呈假阳性，用二抗同种动物正常血清封闭某些非特异性结合位点，（正常血清可提供白蛋白，与组织内非特异蛋白结合，含天然抗体中IgG的FC段与待检标本FC段结合），一般用10%正常血清封闭组织10~15分钟。;抗体与内源性Ig交叉反应：; 六、免疫组化技术掌握共同条件;;3、抗体最佳孵育温度及时间（一抗孵育） 湿盒孵??，以防抗体的蒸发和干片。室温25℃或37℃孵育45~1h或更长时间或转4℃过夜。通过预实验，选择合适稀释度，孵育时间与其成正比。孵育时避免干燥，否则会使抗体活性减低或消失。 ; 胞浆着色 一抗过浓或交叉反应：p63（乳腺）