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A 型流感病毒的反向遗传技术研究进展 卢建红 1,2 * 刘秀梵 1 邵卫星 1 （1 扬州大学 农业部畜禽传染病学重点开放实验室 扬州 225009 ） （2 中南大学肿瘤研究所 长沙 410078 ） 摘要 A 型流感病毒基因组为单股负义 RNA ，分为 8 个片段 。反向遗传技术即从克隆的 cDNA 产生 病毒的过程，是研究 RNA 病毒、也是研究 A 型流感病毒基因结构与功能的新技术。本文介绍了 A 型流感病毒反向遗传技术的发展、完全以质粒为基础的新操作系统及其在研究病毒的生命周期、致 病性、产生基因修饰的疫苗候选株等方面的应用。 关键词 A 型流感病毒 反向遗传技术 质粒基础的操作系统 应用 RNA 病毒 （包括A 型流感病毒）的反向遗传技术或称病毒拯救，是指从克隆的 cDNA 产生感染性病毒的过程，实现了在 cDNA 水平上对 RNA 病毒的操作，从而为病毒的功能 基因组研究提供了强有力的手段[1] ，这一技术是根据病毒基因组特征和复制特点等利用 分子生物学技术而建立和完善起来的，技术体系要满足病毒复制和包装的各种必要条 件。本文将从 A 型流感病毒的基因组特征和复制特点出发，重点介绍流感病毒反向遗传 操作技术的发展与应用。 1 A 型流感病毒的基因组特征与复制特点 A 型流感病毒在温血动物（禽类和哺乳动物）中广泛存在，也是目前致人类和各种 动物流感疾病的主型[2] ，它是正粘病毒科的成员，基因组是单股、负义的 RNA，分为 8 个片段，编码 11 种功能蛋白[2,3] 。HA 和 NA 是病毒表面的 2 种糖蛋白，也是病毒表面抗原， 根据 HA 和 NA 的不同，A 型流感病毒（以下简称流感病毒）又可区分为不同亚型，目前 已鉴定 15 种 HA 和 9 种 NA 亚型[2] 。 流感病毒各基因片段 3′末端和 5′末端的部分序列反向互补，通过碱基配对形成 锅柄状的二级结构，组成 vRNA 的启动子成分，对病毒的复制、核酸内切酶和 mRNA 的多 聚腺苷酸化是必需的。由于基因组不具有感染性，各个 RNA 片段被核蛋白（NP）包裹， 并必须与三个聚合酶亚基 （PB2、PB1、PA）结合在一起形成核糖核蛋白复合物 (RNPs)才 有活性。病毒感染时，首先与宿主细胞表面的特异性 HA 受体结合，通过融膜进入细胞 后，释放出 RNPs，RNPs 进入细胞核才开始病毒基因组的复制和转录，每个 RNA 片段单 独组成一个转录单位，转录出 mRNA 和互补 RNA （cRNA），mRNA 翻译合成病毒蛋白，cRNA 复制生成病毒的负链子代 RNA，进而在细胞浆中组装成完整的病毒粒子[4] 。 收稿日期： *电子信箱：jianhl@ 。 1 2 流感病毒反向遗传技术的发展历史 从克隆的 cDNA 产生 RNA 病毒，最关键的是形成功能性的 RNPs，并且要保证包括病 毒复制启动成分的 3′和 5′末端在内的序列准确 。对于分节段的负链 RNA 病毒，其拯 救工作是个挑战，而且，与大多数负义 RNA 病毒不同，A 型流感病毒基因组在细胞核内 复制，因此必须在细胞核内 同时含有 8 种功能性的 RNPs。 早期通过用去污剂处理病毒或其它方法分离、纯化 NP 和聚合酶蛋白重建 RNP 复合 物（RNPs），证实 RNPs 与短的或全长 vRNA 结合形成了功能完全的 RNPs[5] ，从而也证实 了流感病毒 RNA 复制和转录形成 RNP 最小单位 的中心蛋白是 3 个聚合酶 （P）蛋白和核 蛋白 （NP）。接着，研究者们进一步建立了能稳定表达这 4 种蛋白的系统 （如痘苗病毒、 SV40）或细胞系。这些体系可以对 vRNP 非编码区进行修饰以鉴定其重要的启动与调节 信号作用，也允许对聚合酶和 NP 蛋白的诱变 以研究它们在病毒复制和转录中的功能。 其缺点是无法掌握 P 蛋白和 NP 蛋白的比例使之尽量与 自然感染细胞中的一致，这样就 可能影响到病毒的复制与转录 。但是，这种系统显示出已经能在细胞内人工产生 vRNPs。 在认识到功能 vRNPs