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第一章 RNA的提取和cDNA的合成;RT-PCR原理;一、RNA的提取;采取的措施： 1、全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。 2、所用的玻璃器皿需置于干热灭菌箱中200℃烘烤2h以上。 3、不能用高温烘烤的材料，如塑料容器、试剂等可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理，然后高压灭菌以消除残存的DEPC。 ;注意事项： 1、DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物。 2、DEPC能与氨基和巯基反应，因而含Tris和DTT（二硫苏糖醇）的试剂不能用DEPC处理。 3、Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。 4、配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水配制，并尽可能用未曾开封的试剂。 ;总RNA提取方法（试剂盒）： 异硫氰酸胍－苯酚法（Trizol 法） 原理：（1）Trizol的主要成分是酚。主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。酚是有效的蛋白变性剂，但不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。 异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。;（2）氯仿可使蛋白变性，降低蛋白的溶解度。其主要作用是分相，实际上是加速有机相和水相的分层。上层水相，pH 5.1左右，当溶液pH在酸性的时候，DNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面，只有RNA分子留在水相。而当pH接近中性时，DNA就会溶解在水相，（导致pH中性的原因可能是trizol与样品比例不对，应该尽量保证提取量的前提下使trizol过量）。同时，氯仿可以去除核酸溶液中的痕量的酚。;（3）异丙醇作用是沉淀RNA。异丙醇沉淀，优点是容积小且速度快，主要沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，对5sRNA、tRNA不产生沉淀，所以RNA电泳的标志性三条带中5sRNA带很不清楚，未必是你的RNA降解。但是异丙醇难以挥发出去。 （4）因为上述试剂会影响后续实验，所以用75%乙醇洗1-2次。一是乙醇可以溶解一些沉淀中可能的有机物杂质；二是洗掉异丙醇、氯仿，乙醇易挥发，痕量的乙醇很容易挥发掉。;Yeast Total RNA;二、cDNA的合成;2、鼠白血病病毒(M-MLV)反转录酶 只有单个多肽亚基（最适温度37℃） 活性：依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性，但降解RNA:DNA杂交体中的RNA的能力较弱，且对热的稳定性较AMV反转录酶差。 M-MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。 ;cDNA引物 种类： 1、随机引物：不特异的引物 体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 ;2、Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的引物 绝大多数真核细胞mRNA具有3’-端Poly(A)尾，此引物（12-18核苷酸）与其配对，仅mRNA可被反转录。 由于Poly(A)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机引物得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 ;3、特异性引物 用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 ;第二章 聚合酶链式反应（PCR）;;一、PCR基本步骤;二、PCR反应中的主要成分;4、引物3-端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对。 5、在引物内，尤其在3‘-端应不存在二级结构，且3’-端尽量不用A，尤应避免连续2个或2个以上A，因为A引发错配的几率高；最好选择T。;6、两引物之间尤其在3-端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。 7、引物5-端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点等，通常应在5-端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。 ;8、引物不与模板结合位点以外的序列互补。 引物浓度： 一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。 引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。 ;4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)： dNTP原液一般配成2.5-10mmol/L分装，-20℃贮存。 一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。 当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。 4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。 ;Mg2+： Mg2+浓度对Ta