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地高辛杂交检测试剂盒 I I使用说明书目 录 号：DIGD-10 规 格：10次化学检测反应 保 存 期：12个月 存储条件： CDP-Star 4℃ 阻断液母液(10x) –2℃ 抗DIG-AP 酶结合物 4℃ 其它组分 室温 试剂盒组成： 阻断液母液(10x) 50 ml 抗DIG-AP 酶结合物 0 μl CDP-Star发光底物 50 μl 检测缓冲液(5×) 　　　　 50 ml 马来酸缓冲液(干粉) 可配1L Tween-20 3 ml 10% SDS 20 ml 20×SSC 100 ml 准备工作： 将马来酸缓冲液(干粉)用800ml水溶解。检查pH是否为7.5。定溶至1L。灭菌。马来酸缓冲液0.3% (v/v) Tween-20即为洗涤缓冲液 使用前先用DEPC/无RNase水将5×检测缓冲液稀释成1×工作液。 ： 一．预杂交： 1. 将固定后的膜（可用干净的剪刀将膜溴酚蓝以下的部分剪去）放入杂交袋中，在封口机上将杂交袋三面封口。 2. 加入6℃预热的Hyb高效杂交液5ml，排尽气泡，封口。放6℃水浴振荡杂交1~2小时。 3. 如果使用杂交管杂交，则根据杂交管体积，加入适量的杂交液(5~10ml)。如果膜的大小适中，也可以用无菌的50ml离心管(BD公司)进行，5ml杂交液已足够。将杂交仪设定为6℃，8~15转/分钟预杂交12小时。 二．杂交： 1. 探针的处理：将标记好的探针放1℃煮10分钟，立即放冰浴冷却10分钟。 2. 将杂交袋从水浴中取出，剪去一角并尽可能的排尽袋中的预杂交液，取5ml Hyb高效杂交液，加入变性的探针(1~3μl/膜，5~20ng/ml Hyb杂交液)，混匀。加入到杂交袋中，小心排尽气泡，封口，6℃水浴振荡杂交过夜。 3. 如果使用杂交管杂交，则倒出预杂交液，另取适量的Hyb高效杂交液(5~10ml)，加入变性过的探针(1~3μl/膜，或5~20ng/ml Hyb高效杂交液)，混匀。加入到杂交管中，杂交仪设定为6℃，8~15转/分钟，杂交过夜。 三．洗膜： 剪开杂交袋，用镊子取出膜，放入装有20m的溶液的平皿中，在室温下振荡洗涤两次，每次5分钟。 用镊子将膜转入液(先放5℃水浴预热)中，5℃水浴振荡洗涤两次，每次15分钟。 用镊子将膜取出转入装有20ml洗涤缓冲液的平皿中振荡洗涤5分钟。 四．信号检测 所需试剂： 请按下表组分准备所需试剂。 溶液 制备 储存/ 稳定性 洗 涤 缓冲液 Tween-20按1:0.3% 体积比制备 15~25°C 稳定 马来酸缓冲液 马来酸用NaOH调节到pH 7.5(20°C)15~25°C 稳定 检 测 缓冲液 检测缓冲液(5×)×备用 15~25°C 稳定 10% SDS，双蒸水制备，终浓度为 2×SSC，0.1% SDS 15~25°C 稳定10% SDS，双蒸水制备，终浓度为0.1×SSC，0.1%SDS 15~25°C 稳定 溶液 组分/制备 储 藏稳定性 用途 阻 断 液 用马来酸缓冲液按1:10稀释10×阻断液，制备成1×工作液。 每次新鲜制备 阻断非特异性结合位点 抗 体 溶 液 每次使用前，需10,000rpm离心抗Dig-AP 5分钟，从表面小心吸取所需的量。用阻断液按1:000稀释抗体。 2~8°C 12小时 结合DIG标记的探针 底物液 μl CDP-Star 到1ml检测缓冲液中。 每次新鲜制备 显现抗体结合 流程：在7~100cm2的上进行信号检测。 注意: 所有孵育过程应在15~2°C下搅动进行如果膜要用于再杂交，则不要让膜在任何时候变干。 步骤 操　作 1 在杂交和严谨洗涤后，在洗涤缓冲液中浸润1-5分钟。 2 在20~30ml阻断液中孵育30分钟。 3 在10ml抗体液中孵育30分钟。 4 用20~30ml洗涤液洗涤2(15分钟。 5 在15ml检测缓冲液中平衡2~5分钟。 6 1ml新鲜配制的发光底物液，然后缓慢放下上层保鲜膜，使底物均匀地覆盖膜的表面。于室温静置作用5min。