实时荧光定量PCR技术的类型、特点与应用.pdfVIP

中国畜牧兽医 2008年第35卷第3期 生物技术 ·27· 实时荧光定量PCR技术的类型、特点与应用 袁亚男．刘文忠 (山西农业大学动物科技学院，太谷030801) 摘要：实时荧光定量PCR技术是一种利用不同的荧光检测方法来定量核酸的技术，具有高度的灵敏性、特异性和精确性。 该技术根据荧光作用方式分为：SYBR荧光染料法、TaqMan技术、分子信标和复合探针等类型，依据其各自优缺点可将各技 术方法分别应用于畜牧兽医领域不同方面的科研工作中，以期得到最优的定量检测效率。 关键词：实时荧光定量PCR技术；荧光共振能量转移；荧光探针；淬灭探针 中图分类号：$813．3 文献标识码：A 文章编号：1671—7236(2008)03—0027—04 fluores- 实时荧光定量PCR技术(real—time成线性关系，从而得出产物的扩增曲线。理想的扩 cence quantitativePCR，RTFQPCR)是1996年由 增曲线应为J型，符合2N方程(其中N为PCR的循 美国AppliedBiosystems公司推出的一种新技术， 环次数)，但实际上扩增曲线为S型。在PCR反应 它不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常 早期，不能将产生荧光的水平与背景明显区别，之后 规PCR相比，具有灵敏度高、特异性强、有效解决 荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因 PCR污染问题、自动化程度高等特点。作者综述了 此可以在指数期的某一点上检测PCR产物的量，并 实时荧光定量PCR技术的基本原理、主要类型、特 由此推断起始模板含量。 点及其在畜牧兽医领域的应用。 实时荧光定量PCR的标准扩增曲线如图1。 1 实时荧光定量PCR技术的基本原理 其中Rn+表示每点测量的荧光强度，代表反应管含 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反 有模板DNA；Rn一表示荧光基线强度，代表反应管 应体系中加入荧光基团，利用荧光积累实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定 不含有模板DNA，其在理想情况下是一条平线，只 量分析的方法。该技术结合了实时定量PCR仪、实 具有背景荧光数值；ARn的值表示PCR过程中，探 时荧光定量试剂、通用电脑和自动分析软件，构成 PCR-DNA／RNA实时荧光定量检测系统。 是背景曲线的一段，范围为从反应开始不久荧光值 荧光探针技术是根据标记基团的荧光共振能量 开始变得稳定，到所有反应管的荧光都将要但是还 resonance transfer， 转移(fluorescenceenergy 未超出背景(宋敏等，2005)。 FRET)原理而实现的。当某个荧光基团的发射光 谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且2个基团 环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline)，荧光阈 距离足够近时，能量可以从短波长(高能量)的荧光 值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号标准差的 基团传递到长波长(低能量)的荧光基团，相当于短 10倍，即：Threshold—IOSD(cycle3～15)，一般认 波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为 为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的 FRET。 信号，可以用于