兔胸腺HMGN2的分离纯化鉴定.docVIP

　　兔胸腺HMGN2的分离纯化鉴定 【关键词】 兔胸腺；HMGN2；分离 高迁移率非组蛋白(High mobility group chromosomal protein, HMG)是脊椎动物和非脊椎动物的细胞核中含量最为丰富的非组蛋白家族[9]，这一家族的成员普遍存在于高等真核生物中，目前HMG蛋白分为三个亚家族，分别为HMGA、HMGB和HMGN。HMGN2为HMGN亚家族的成员，其基因位于染色体1q35,相对分子质量为9.2KD，共由90个氨基酸组成。已有研究表明，HMGN2结合于染色体的特异部位，是染色体纤维构成必不可少的部分[2,3]，参与DNA的复制和转录[1]，与转录活性基因有关[5]，能解开致密染色体的折叠结构从而有利于复制和转录的启动[6]。本实验室首次发现HMGN2具有明显的抗菌活性[4]。为了进一步研究HMGN2的生物学功能，我们利用琼脂糖弥散抗菌法鉴定内源性抗菌肽的方法，分离纯化兔胸腺HMGN2。 1 材料和方法 1.1实验材料 主要材料:兔胸腺，致病性大肠埃希菌临床分离株54080、大肠埃希菌ATCC25922。主要试剂:丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，TEMED，蛋白质Marker为Merck产品；Tris、Tricine、琼脂糖、大豆培养基、三氟乙酸、溶菌酶、牛血清白蛋白（BSA）为Simga产品；乙腈为Fisher产品；抗HMGN2多克隆抗体为Upstate产品；色谱纯水为Millipore超纯水；考马斯亮兰R250为上海试剂厂进口分装产品；反应试剂盒BCA Protein Assay Kit为PIERCE公司产品；其余试剂为国产分析纯。主要仪器：高速离心机（BECKMAN COULTER Avanti J30I,美国）、反相高效液相色谱仪HP1100(惠普公司)、电泳装置为（BIORAD POGN2 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳初步确定上述各单峰的相对分子量，以及其纯度，所用浓缩胶浓度为4%T、3%C,分离胶浓度为16.5%T、3%C。胶厚0.75nm。电泳条件: 80V恒压,3.54小时。电泳完毕后进行考马斯亮蓝染色1小时,脱色过夜后进行观察。 1.2.4 GN2TricineSDSPAGE电泳完毕后，利用半干转移法将胶上条带转移到PVDF膜上，10%BSA封闭1小时膜后，加入HMGN2抗体4 ℃孵育过夜，次日漂洗后用辣根过氧化酶标记的抗兔IgGHRP室温孵育1小时后，洗涤三次，PVDF膜蛋白面向上，DAB显色液显色后观察试验结果。 1.2.5 HMGN2对大肠埃希菌的杀菌功能鉴定参照Lehrer等[14]的方法对HMGN2的抗菌功能进行检测:用PBS作为阴性对照，HNP为阳性对照，HMGN2的稀释浓度依次为4、2、1、0.5 μg·μl1。37 ℃孵育过夜，观察杀菌环直径大小判断杀菌功能强弱。实验做三复孔，重复三次。 2 实验结果 2.1HMGN2分离纯化及鉴定 新鲜兔胸腺组织酸溶性粗提物经RPHPLC分离后各组分出峰时间如图1所示，主要色谱峰集中在2040分钟。第20分钟的分离物为兔胸腺HMGN2。图2显示经RPHPLC所得的第二十分钟分离物行TricineSDSPAGE电泳后考马斯亮蓝染色分析结果，可见其分子量介于14和18之间。图3所示为GN2经DAB显色液显色后结果。 HMGN2作为HMG三大家族的一员，是进化保守的，因其分子量小，聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移快速而得名。因其含量丰富，学者们对它的研究也是极其广泛的。早在80年代就有不少学者从牛，鼠，兔等动物中分离提纯出HMGN2，并且对它的生物学活性进行了充分的研究，发现它不仅与维持染色体的结构[10]、细胞的功能、基因的转录和活化过程[11,12]有密切关系外，随后发现其具有很强的杀菌功能[13]。而且因为抗菌肽的杀菌机制完全不同于传统的抗菌药物，因此HMGN2的抗菌机制也受到广大学者的关注。随着研究的深入，目前对其在细胞免疫和抗病毒功能上的研究也日趋增多，本实验室首次从兔胸腺利用液氮研磨，高氯酸萃取，反相高压液相色谱纯化的方法分离提纯出高纯度的HMGN2，为下一步对其抗菌机制的研究奠定基础。 【 参考 文献 】 1 K.L. GN proteins play roles in DNA repair and gene expression in mammalian cells[J].Biochemical Society Transactions, 2004,32(6):918-919. 2 Bustin M. Chromatin unfolding and activation by HMGN (*) chromosomal proteins[J]. Trends Biochem Sc