“免疫微环境分子预测模型”的建立与验证.DOC

附件2 论文中英文摘要 作者姓名：高强 论文题目：免疫微环境与肝细胞癌复发转移及“免疫微环境分子预测模型”的建立与验证 作者简介：高强，男，1981年4月出生，2005年9月师从于复旦大学樊嘉教授，于2008年6月获博士学位。 中 文 摘 要 肝细胞癌（肝癌）为我国的第二位癌症死因，其高转移复发率（5年达70％，小肝癌也高达50％）已成为进一步提高远期疗效的瓶颈。临床上迫切需要寻找新的手段以准确地预测肝癌的复发转移、并在此基础上设计新的有效干预治疗。以癌细胞本身为对象的传统研究，由于癌细胞的异质性、不稳定性，目前仍无突破性进展。 肿瘤不是一个孤岛，孤立对肿瘤细胞本身的研究片面、局限，无法解释肿瘤的发生发展。目前认为，肿瘤源于正常细胞与促癌微环境相互作用；这种动态相互作用是肿瘤不断恶变并发生转移的基础；相对稳定和异质性小的微环境更是无比优越的治疗靶点。不容忽视，作为肿瘤微环境这一有机整体的必要组分，免疫微环境及其状态影响甚至决定着肿瘤的演进与预后：在某些肿瘤，微环境免疫学因素甚至是一个优于TNM分期的、迄今为止最准确的独立预后指标；免疫逃逸更被称为肿瘤的“第七大标志性特征”。因此，新的理论认为肿瘤是一种免疫和微环境疾病。基因组学、组织微阵列以及其他高通量研究技术的兴起与日益完善，为肿瘤微环境研究提供了技术与理论保证，既可对以往建立在现象观察基础上的假说进行进一步验证，又可在大规模、无偏倚观察基础上提出新的理论与设想，从而大大推动研究的精确性与进程，成为目前肿瘤学研究的一个方兴未艾的热点，受到了广泛关注。 作为免疫特惠器官，肝脏具有独特的免疫系统并参与局部及整体的免疫调节。肝癌更是在异常的免疫/炎症、纤维化、肝硬化微环境下诱发的恶性肿瘤，可以说是个最典型的“免疫和微环境”肿瘤。有理由相信，肝癌免疫微环境在肝癌发生发展和侵袭转移的演进过程中发挥了异常重要的作用。鉴于此，本研究即从细胞和分子水平全面系统探索了免疫微环境在肝癌复发转移中的作用。 【目的】 1、从免疫活性细胞的角度，原位、在体、系统地研究肝癌微环境树突状细胞(DC)和T淋巴细胞的类型（亚型）、数目、部位与功能状态在肝癌复发转移中的作用；2、寻找最适合肝癌real time RT-PCR实验用的内参照基因（HKG），为分子水平的研究提供基础和保证；3、在分子水平，研究肝癌微环境过继免疫（Adaptive immunity）为主的免疫效应、免疫抑制（Immunosuppression）和炎症（Inflammation）相关的标志性基因的表达谱及其与肿瘤复发转移的关系，建立与肝癌复发转移相关的“免疫微环境分子预测模型”；4、验证“免疫微环境分子预测模型”的有效性和稳定性。 【方法】 1、在细胞水平，随机选取两组行手术切除的肝癌患者：队列A（n=123）和B（n=302）。队列A：常规组织切片，利用HE、普通及双重免疫组化染色，研究癌内及癌旁微环境S100+DC、CD3+总T、CD8+效应T和CD45RO+记忆T形态、分布、（绝对）数目及其与癌转移复发的关系；队列B：借助组织微阵列及免疫组化，研究癌内及癌旁微环境FoxP3+调节性T细胞(Treg)、Granzyme B+活化的细胞毒性细胞(aCTL)的分布、（绝对）数目与肝癌复发转移的关系。 2、选取肝癌中最常用的（ACTB、GAPDH）、及其他肿瘤中已证实合格的（HPRT、TBP、B2M）、且隶属于不同功能家族的5个HKG为候选基因。Real time PCR检测候选基因在65例癌和癌旁配对的组织标本的表达，常规统计、NormFinder和geNorm软件分析HKG的稳定性。 3、在分子水平，随机选取130例手术切除肝癌患者作为模型建立组；确立27个免疫效应/过继免疫、免疫抑制和炎症相关的代表性、标志性基因为目的基因；实时荧光定量PCR微阵列芯片检测上述基因的表达，Cluster和Treeview软件对基因表达进行回顾性非监督聚类分析（Unsupervised Hierarchical Cluster）和相关性矩阵分析（Correlation Matrix），及聚类结果的生存分析；用复发评分模型（Recurrence Score）建立肝癌复发转移相关的、来源于微环境和机体免疫特征的前瞻性预测模型。 4、另外随机选取120例手术切除肝癌患者作为模型验证组，利用real time PCR检测“免疫微环境分子预测模型”中所涉及基因的表达，将其直接应用于上述预测模型中，通过生存分析以检验该模型的稳定性、有效性和通用性； 【结果】 1、免疫活性细胞类型（亚型）、数目、部位与功能状态与肝癌复发转移 队列A：HE染色下癌与癌周的淋巴细胞密度分级与无瘤生存无明显相关（P = 0.054, 0.071）。免疫组化结合细胞绝对计数，多因素