ShuffleT7-K12感受态细胞.PDF

Shuffle T7-K12 感受态细胞 目录号：BC208 储存条件：-70℃保存，避免反复冻融。 组成 BC208-01 BC208-02 ShuffleT7-K12 Competent cells 10×100μl 20×100μl pUC19 （0.1ng/μl） 5μl 5μl 产品说明： ShuffleT7-K12 K12 T7 菌株来源于大肠杆菌 菌株，适用于 启动子启动的蛋白表达。细胞内组成型表达的二 硫键异构酶DsbC不仅有利于表达蛋白形成正确的二硫键，并具有分子伴侣的功能，帮助不含二硫键的蛋白正 T7RNA lac lac 确折叠。 聚合酶基因整合在细菌染色体上的 操纵子区域，组成型表达的 阻遏蛋白能降低基因的 λ T1 ShuffleT7-K12 背景表达，有利于毒性蛋白的表达，没有 前噬菌体序列，具有抗 噬菌体感染特点。 感受态细 6 胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率大于10 cfu/μgDNA。 基因型： F′lac,pro, lacIQ/  (ara-leu)7697 araD139 fhuA2 lacZ::T7 gene1(phoA) PvuIIphoR ahpC*galE (or U) galK R R λatt::pNEB3-r1-cDsbC(Spec ,lacIq) trxBrpsL150(Str ) gor  (malF)3 菌株抗性：对氨苄青霉素，氯霉素，卡那霉素和四环素敏感，对链霉素和壮观霉素有抗性。 质粒转化步骤： 1. 将感受态细胞置于冰水浴中化冻。待细胞刚化冻后，加入 1-5μl 含有 1-100ng 的质粒DNA 到细胞中， 用手指拨打管底，轻轻混匀； 2. 冰水浴中放置30分钟，不要晃动； 3.42℃热击60秒钟，不要晃动； 4. 冰水浴中放置2 分钟，不要晃动； 5. 加入500μl 的室温的SOC 或LB 培养基； 6. 置于30℃摇床中，150-200rpm，复苏培养60 分钟； 7. 取50-100μl 菌液涂布在含有抗性的LB 平板上。待液体吸干后，倒置平板30℃培养 12-24 小时。 （平板划线分离法：复苏培养结束后，12000rpm 离心30秒钟，弃掉上清，留100μl 左右的液体，用200μl 吸头轻轻吹打散菌块，取10μl 重悬的菌液分多点滴在平板上，倾斜吸头，用吸头头部的侧面将滴在平板上的 液体来回划线。这个方法可以获得更多更大的单克隆菌落。） （质粒快速转化步骤：将步骤2 的时间缩短到5分钟，对于氨苄青霉素抗性的质粒，步骤4 完成后，可直 接涂布或划线于含抗生素的平板上。其它抗性的质粒仍需40-60分钟的复苏培养。） 蛋白表达步骤： 1. 5ml LB 挑取单菌落，接种到含 带抗生素的 培养基中； 2.30 200rpm OD 0.4-0.8 ℃， 震荡培养细菌至对数生长期 （ 600 ）； 3. IPTG 0.4mM 30 4 16 加入 到终浓度为 ， ℃诱导 小时或 ℃诱导过夜； 4. 诱导完成后，离心收集菌体，用合适的方法 （如考马斯亮蓝染胶法，Western-Blot法或酶活性分析法） 分析菌体裂解物的总蛋白、上清和沉淀组分，明确表达产物的表达状况 （可溶性或不溶性表达）； 5. 10ml 1L OD 0.4-0.8 重组蛋白大量表达时，可用 过夜培养